关于临床酶测定标准化的一些问题
迄今，血清(血浆)中酶测定是通过它们催化的反应速度测量的，以酶催化(活性)浓度表示。这与以免疫实验将酶作为蛋白质测定比较，其优点是快速、敏感、特异和低消耗。但是，酶催化浓度测定结果是相对的，它依从于测定原理、单位定义和相应的测定条件。这些条件中，主要是：(1)底物、辅因子、活化剂、变构剂的种类和浓度。(2)在偶联酶促反应中，指示酶和辅助酶的种类和浓度。(3)反应混合液的pH、缓冲剂种类和离子强度。(4)其它影响酶催化反应的因素，如抑制剂、杂酶等。这些影响酶促反应速度的诸因素中任何一项发生变动，都会导致测定结果不同程度的变化。正是由于这些原因，使酶测定的质量控制远远落后于其它生化项目［１］。
为了提高酶测定实验的准确性和精密度，为了使酶测定结果在方法间，实验室间有可比性，消除参考范围的多重混乱，以利于临床应用，开展酶测定的标准化工作势在必行。标准化乃是一项技术措施。近20年来，国内外主要从二个方面开展了酶测定的标准化活动：一是提出和使用推荐方法(recommended method)；二是使用参考方法(reference method)定值的酶参考物去校正常规方法［２］。
在国际上，国际临床化学联合会(IFCC)自1979年首先发表了测定人血清(血浆)中酶催化浓度方法总则［３］。1985年提出了天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)的推荐方法［４，５］。随后，γ-谷氨酰基转换酶(GGT)［６］、碱性磷酸酶(ALP)［７］、肌酸激酶(CK)［８］、乳酸脱氢酶(LDH)［９］的推荐方法相继推出。1996年10月又提出了α-淀粉酶的推荐法(征求意见稿)。某些国家和地区也提出各自的多种酶测定推荐方法，与IFCC的相应方法比较都或多或少地存在一些差异。通过推荐方法在一定范围内的实施，期望使有关酶的测定方法规范化、一致化，使各实验室间对同一种酶的测定结果有可比性、互换性或称可移植性(commutability)，并获得酶测定的最大准确度和精密度。实践已证明这项措施的推行已取得相当大的成功。在这项活动中使很多实验室发现了他们原来方法的缺点，设法消除偏差，提高了酶测定实验的质量；一些准确性差的方法被阻止或被淘汰；促使一些试剂盒生产厂家在选择测定原理和试剂配方等方面向推荐方法靠拢。为了同样目的，我国检验学会也于1993年8月讨论通过，1994年3月发表了《中华医学会检验学会酶催化浓度测定的推荐方法》第一部分《测定人血清(血浆)中酶催化浓度方法总则》［１０］。在《总则》中提出所推荐方法应考虑的五点基本原则和建立推荐方法一般应经过的三个步骤。1995年12月通过了ALT［１１］、GGT［１２］和CK［１３］三项推荐方法(草案)；1996年12月通过了LDH［１４］、ALP［１５］、AST［１６］三项推荐方法(草案)。毋庸置疑，这些推荐方法在我国的实施必将推动我国临床酶测定标准化的进程，但只能是个良好开端。国际上推行推荐方法尽管已取得不可忽视的成绩，但经过近20年的努力，欲使一种酶的测定广泛、普遍采用推荐的单一方法的目标并未达到。其原因是多方面的，包括学术观点的不同，实验研究结果的差异，跟踪技术进步的速度快慢及各实验室物质条件的限制等。这些问题不可避免地也会在我国实施推荐方法过程中有这样那样的表现，我们应当未雨绸缪，使方法推荐活动求实有效，为了达到预期目的，一方面要继续完善已提出的推荐方法，再提出其它(如α-淀粉酶)推荐方法；二要创造条件，包括实验研究用的原料试剂和检测仪器，使已提出的推荐方法在临床检验“四要素”——仪器、试剂、方法学和人，均优秀的实验室扎根，随时可以用推荐方法去校正常规方法，给酶参考物定值；三并不期望也不可能将这些推荐方法立即广泛地用于服务性常规实验室，那么就存在一个如何使常规酶测定方法向推荐方法靠扰，使同一项酶的测定在室内、室间测定结果取得最大准确性和重复性的问题。目前酶测定大都采用连续监测法、自动分析和使用商品试制盒，在仪器规格性能尚不统一的情况下，除从室内质控和室间质评的基础工作出发，加强仪器性能检测校正 (特别是波长和温度控制的准确性和稳定性等)外，应加强对商品试剂盒的质量检定。促进试剂盒生产厂家尽可能地按推荐方法提出的原理、试剂配方生产，逐步使进入常规实验室的试剂盒先统一、规范起来。卫生部已公布ALT、AST、酸性磷酸酶(ACP)、ALP、GGT、LDH、CK、α-羟基丁酸脱氢酶(α-HBDH)、胆碱酯酶(CHE)、脂肪酶(LPS)、肌酸激酶-同工酶MB(CK-MB)、5′-核苷酸酶(5′-NA)、丙酮酸激酶(PK)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)、淀粉酶(α-Amylase)和LDH1共16项试剂质量检定标准。关于准确性的检定标准，后5项“暂缺”，而前11个酶的不准确性都定为≤10%，检定方法都“暂定与定值血清靶值”比较。其中，GGT试剂盒接受检定的必须采用γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺(Glucana)为底物，这就可以使γ-谷氨酰-对-硝基苯胺为底物的试剂盒被淘汰。这与IFCC和我国的GGT推荐法相一致。现在已知后者因溶解度限制，使用浓度只能达到4 mmol/L，相当于其Km(0.98 mmol/L)的4.1倍，测定准确性低(?%)，而推荐方法中Glucana溶解度好，采用6 mmol/L浓度，相当于Km(0.65 mmol/L)的9.23倍，使测定准确性达95%以上。另如，ALP试剂盒接受检定的产品必须使用2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2A2M1P)为缓冲剂，而不接受以二乙醇胺(DEA)或碳酸盐为缓冲剂的产品，这也将有利于提高ALP测定结果的室间可比性，提高测定的准确性［１］。这与IFCC的推荐方法一致，但与1989年日本JSCC和我国1996年提出的推荐方法不同，后二者采用的缓冲液是2-乙基氨基乙醇(EAE)。EAE优于2A2M1P已有论述［１５］。在LDH一项中，检定标准规定的反应方向与推荐法一样是L→P，这就可以避免L→P和P→L二种试剂盒并存造成的LDH测定结果的混乱。当然，需讨论的问题还有很多，在此不一一赘述。总之，“与定值血清靶值”比较将显示出试剂盒质量的优劣。但问题是：(1)“定值血清”是什么血清?是人的混合血清还是动物血清或是蛋白含量和离子成份与人血清相似的“人造血清”?(2)向血清中加入的酶是人血清或组织来源的酶，还是动物组织来源的酶，还是基因工程细胞的酶?(3)给血清中各种酶定值采用什么方法?由什么实验室参与定值?“靶值”如何确定等等。对这些问题必须有科学明确的答案，才能使准确性的检定科学有效。
iFCC已于1989年提出了一个关于《酶测定参考物》的文件(草案)，按要求应当由参考实验室采用参考方法给酶定值。现已有欧洲(CBR)和美国(NBS)的酶校正物，它们都是在严格指定的测定程序中，提供一个有确切催化浓度的测定靶值。CBR的酶参考物定值项目包括ALP、GGT、ALT、CK；NBS的SRM-909定值项目包括ACP、ALP、ALT、AST、CK、LDH、GGT。多项研究使用这些酶校正物成功地以IFCC推荐方法校正了各自地区性的推荐方法，用严谨科学的实验研究证明了二种方法间的可移值性。同样，在确定常规方法与推荐法间是否有可移值性的过程，需要理论和实验研究的结合；待接受酶参考物校正的常规方法或待检定质量的商品试剂盒，在分析原理上要与定值用的参考方法相同；第二要用实验证明二种方法对酶校正物和一定数目的病人标本的分析应答相同。其中包括对目标酶有同样或非常接近的特异性；对存在的同工酶或同工酶亚型有相似的选择性；对内源性酶促或非酶促“旁路反应”(“Side reaction”)有相似的不敏感性。应指出，参考方法的性能特点，如精密度和无偏差等，并不会因为其定值的校正物使用而转移到常规方法身上，校正后的结果质量反映的仍是常规方法自身的性能特点。具有可移植性的二个方法间应有一个恒定的数学相关，并应依此将被校正的方法参考值做相应的转换。多年来，国内外的实验研究都证明，必须非常恰当、严格的选择校正物和测定方法，才能科学有效地用一种方法去校正另一种方法。否则，即使有了一种用参考方法定值、性能稳定的酶校正物，而不问青红皂白，不做深入细致的实验或调查，一律要求在常规实验室中，将各种常规方法的测定结果硬性“拉到”校正物定值上，把酶校正物简单地当作一般代谢物的已知纯度的标准物那样使用，这不仅不会提高酶实验质量，无助于酶测定的标准化，相反会造成测定结果和临床应用的混乱［17］。
酶测定的标准化是一项艰巨、科学性强的任务，需从理论、实验和组织上做深入、细致、持久的工作。当前，国内尚无参考实验室，为了开展这项工作，在此建议：(1)选择几个“四要素”均属优秀的实验室，作为国内酶测定标准化的带头者，在制订和推行推荐方法，研制酶参考物质，给酶参考物定值等活动中发挥作用，同时创造条件早日建立国家级酶学参考实验室。(2)通过严格认真的法定试剂质检工作，促进商品试剂盒质量提高，规格统一。(3)重视相关企业对推进酶测定标准化的作用，开发和引进性能稳定、适合国情的酶参考物。(4)在酶测定标准化进程中，更要强调加强各级技术人员临床酶学基础理论和实验技术的培训。
参考文献
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11 杨振华.中华医学会检验学会的丙氨酸氨基转换酶(ALT)催化活性浓度测定的推荐方法(讨论稿).临床检验信息导报，1996，1：4-11.
12 王毓三，孟泽.中华医学会检验学会的γ-谷氨酰基移换酶(GGT)催化活性浓度测定的推荐方法(讨论稿).临床检验信息导报，1996，1：10-16.
13 许绍辉，陈映.中华医学会检验学会的肌酸激酶(CK)催化活性浓度测定的推荐方法(讨论稿).临床检验信息导报，1996，1：17-25.
14 文庆成，陈伟英.中华医学会检验学会的天门冬氨酸氨基转移酶(AST)催化活性浓度测定的推荐方法(讨论稿).临床检验信息导报，1997，1：5-8.
15 许绍辉.中华医学会检验学会的乳酸脱氢酶(LD)催化活性浓度测定的推荐方法(讨论稿).临床检验信息导报，1997，1：10-14.
16 孟泽，王毓三.中华医学会检验学会的碱性磷酸酶(ALP)催化活性浓度测定的推荐方法(讨论稿).临床检验信息导报，1997，1：5-19.
17 Moss DW. Enzyme reference materials: Their place in diagnostic enzymology.J iFCC, 1994, 1:6-9.
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