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免疫组化质量控制之实验质控对照的设立

2021.6.23

对于免疫组织化学染色的内部质控程序来说，主要的步骤便是对照的设立。只有设立阳性对照和阴性对照，才能确保免疫组织化学染色过程的准确性、抗体及相关试剂的有效性，并可以确认染色结果的真实性。由于免疫组织化学染色有可能出现假阳性和假阴性结果，因此每次实验都必须同时设立阳性对照和阴性对照，以达到质控的最佳效果。对照的设立包括试剂对照和组织对照，以及内部对照，分别都可以作为阳性和阴性对照。

试剂对照

Battifora提出在每次免疫组织化学染色中增加波形蛋白（vimentin）染色作为阳性对照，目的是观察福尔马林固定后抗原表达的敏感性，对福尔马林固定后抗原损伤的程度进行分析。单克隆抗体V9可以识别vimentin的一个抗原决定簇并且对福尔马林固定敏感，对组织的固定有「报告」功能，可以用于评估组织经福尔马林固定后抗原的敏感性表达情况。

阳性对照可用于确认免疫组织化学染色是否出现假阴性结果。同时也须检测免疫组织化学阳性结果是否为假阳性结果；这就需要在每例待测组织的免疫组织化学染色中都应用阴性对照，利用阴性试剂代替一抗以检测非特异性染色。

阴性试剂对照是指，免疫组织化学染色时加入一张待测病例组织切片作为阴性对照片，除了不加一抗而用其他阴性试剂（缓冲液、组织培养液、非免疫性血清稀释液等）代替之外，处理方法和染色过程与其他待测切片完全一致。当用不同的抗体标记同一例待测组织蜡块的连续切片时，如果所有的切片使用同一种抗原修复方式，那么所染色的每例待测组织蜡块只需要一张阴性对照片。

重要的是，阴性对照片必须使用与待测切片相同的抗原修复方式（蛋白酶消化、微波修复、高压修复等等），且所有的阴性对照实验应不呈现阳性反应。如果出现阳性反应，经常是由组织内源性物质所引起的假阳性反应，如内源性生物素、内源性过氧化物酶、内源性Ig，有FC段受体的细胞（如巨噬细胞、淋巴细胞等），嗜酸性白细胞、胶原细胞以及坏死细胞非特异蛋白吸附等原因引起的。

组织对照

在日常免疫组织化学染色中，每一种抗体都需设立一张单独的阳性或阴性组织对照片，以确认抗体及其他试剂是否有效，染色过程是否正常。对照组织与待测病例组织只在组织固定和处理方面存在差异，因此组织对照可以作为除了组织固定和处理这两个步骤之外，所有试剂和方法步骤的对照。

虽然上述阳性对照片可以检测试剂是否可靠，但并不能保证可靠的试剂确实是以正确的形式滴加到待测病例组织上（因为它们没有在同一张切片上）。另外，单独设立的阳性对照片费用较高，免疫组织化学实验室内通常有所有染色切片数的相当一部分作为阳性对照片，而且单独滴加至阳性对照片上的试剂也加高了成本。

另外，在有些病理实验室中，阳性对照片只包含1例已知为待测抗体阳性的组织。这种阳性对照是不够充分的，而且有可能识别不出假阳性或假阴性结果，因为它并不能检测和验证免疫组织化学染色的敏感性（多少阳性组织为阳性）或特异性（多少阴性组织不会与待测抗体反应）。如果有可能的话，这两个因素在每次染色时都必须得到验证。

有一种比较节省且更有效的方法：将多种不同的组织制作成多组织对照蜡块，并在切片后与待测病例组织放置于同一张切片上，这样对照组织便可以与待测病例组织进行完全相同的免疫组织化学染色过程。因此，在免疫组织化学染色中使用多组织对照是有保证的质控方法。

多组织蜡块有许多优点：

① 多组织蜡块与待测病例蜡块是在同一张切片上，可以确保两者所进行的免疫组织化学染色步骤及使用的所有试剂都完全相同，避免了对照片与待测组织片之间的染色过程出现不一致的情况，而且所需的试剂也不会因为加入对照组织而增加多少，从而控制了染色成本。

② 多组织蜡块是由不同组织构成，可以允许在一张切片上同时测试多种阳性组织（具有不同的抗原位点），及多种阴性组织（不表达待测抗体）。因此，可以同时确保阴性组织的确为阴性（特异性）及阳性组织的确为阳性（敏感性），避免了假阴性和假阳性结果造成的误诊。

③ 多组织蜡块是用作阳性对照片的理想材料。如果多组织蜡块中的组织成分选择得当的话，一例多组织蜡块便可作为几乎所有免疫组织化学染色的阳性对照片，避免了为每种抗体的免疫组织化学染色都准备不同的阳性对照片的需要。

免疫组织化学实验室内应用最广泛的多组织蜡块制作方法包括，「腊肠」蜡块技术或多肿瘤组织夹心蜡块（multitumor sandwich blocks，MTSB），与组织芯片技术（tissue microarray，TMA）。另外，也有学者提出使用3例组织作为对照的方法，其中3个组织分别为待测抗体阴性、弱阳性（+）和强阳性（++）的组织。

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免疫组化质量控制之实验质控对照的设立

周锦帆