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痘苗病毒系统基因表达实验（一）

2019.3.26

本节介绍依赖于在哺乳动物细胞质合成噬菌体 T7 RNA 聚合酶的瞬时细胞质表达系统。首先，将感兴趣的基因插入质粒中，使其位于 T7 RNA 聚合酶启动子（P_T7）的控制下。应用脂质体转染，重组质粒进入感染了 vTF7-3 的细胞质中，而 vTF7-3 是一种能编码噬菌体T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒（见「重组痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂质体转染」）。在培养过程中，外源基因被高效的 T7 RNA 聚合酶转录。这种转染方案适用于分析的目的，因为不需要构建新的重组病毒，所以比较简单。

对于大规模的工作，P_T7 操纵的基因可以通过同源重组插入另一个重组痘苗病毒中，使之与 vTF7-3 共同感染悬浮细胞（见「两种重组痘苗病毒共感染细胞」）表达的蛋白质可以用脉冲标记的方法或用「重组痘苗病毒及其产物的鉴定实验」中叙述的方法分析鉴定，用「离子交换层析实验」描述的方法纯化。

重组痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂质体转染

实验方法原理	本方案从构建外源基因位于 P_T7 和 T7 终止子之间的质粒载体开始，然后用重组质粒通过脂质体介导转染已经被vTF7-3（可以持续表达T7 RNA聚合酶的痘苗病毒）感染的细胞。收获后，基因产物在细胞内的表达可以用脉冲标记的方法或用「重组痘苗病毒及其产物的鉴定实验」中叙述的方法分析鉴定。
实验材料	脂质体悬液 vTF7-3 痘苗病毒储液生长至汇片的 CV-1 细胞重组质粒
试剂、试剂盒	低血清 Opti-MEMI 培养基完全 DMEM-10 培养基
仪器、耗材	6 孔组织培养板杯状超声仪聚苯乙烯管
实验步骤	1. 用 CsCl/溴化乙锭离心或 PEG 沉淀纯化重组质粒，每孔细胞需要 5 μg DNA 进行转染。如果使用 pTM1 质粒（图 16.16.2）, 必须保证目的基因起始 ATG 位于 pTM1 的 NcoI 位点。可以通过限制酶作图或 DNA 测序鉴定构建是否正确。 2. 在病毒感染前一天，用完全 MEM-10 培养基将 5×10⁵ CV-1 细胞/孔加入 6 孔组织培养板培养。直至细胞几乎汇片生长（一般过夜）。用血球计数器对细胞进行计数。 3. 将 vTF7-3 储液涡旋混匀以打散团状物。按照下面的步骤用杯状超声仪进行超声： 3.1 在杯中装入冰水（大约 50％的冰）； 3.2 将装有 vTF7-3 储液的小管放在冰水上； 3.3 以最大功率超声 30 s，储液置冰水上 >30 s，再继续超声。 4. 用 Opti-MEMI 将病毒稀释至 2×10⁷ pfu/ml。 5. 用 0.5 ml/孔的稀释病毒储液（10 pfu/细胞）感染步骤 2 制备的 CV-1 细胞。温育 30 min，每 5～10 min 晃动一次。 6. 在感染结束前 5 min 制备脂质体悬液。加入 1 ml 的 Opti-MEMI 至 12 mm× 75 mm 聚苯乙烯管中（每孔制备一管），涡旋脂质体悬液，加 15 μl 至培养基中，涡旋混匀。加入 5 μg 的重组质粒（来自步骤 1），轻轻混合均匀。脂质体在储存期间会沉淀，因此在使用前，应将其涡旋混匀。不要使用聚丙烯管，因为 DNA/脂质体混合物会吸附在其表面。 7. 吸出 CV-1 细胞的病毒接种物，直接加入 DNA/脂质体混合物。培养 5～24 h，表达的蛋白质可以用脉冲标记的方法或用「重组痘苗病毒及其产物的鉴定实验」中叙述的方法鉴定。收起
注意事项	1. 所有培养都在加湿的 37℃ 5% CO₂ 培养箱中培养，除非有特殊说明。 2. 与活细胞接触的器械和试剂都应该是无菌的，操作也必须无菌。
其他	重组质粒：将目的基因亚克隆到 pTF7-5 或 pTM1 载体或其他含有 T7 启动子的质粒。

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周锦帆