分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

文献解读|分层组装的DNA线框纳米结构，可用于...（二）

2021.1.18

这种DNA八面体的可寻址性和可预见性允许地装载不同数量的单链CA4-FS。作为概念验证，作者构建了半负载CA4-八面体（hCA4-Oct）和全负载CA4-Oct，并测定了负载效率（图1c）。为了进一步验证hCA4-Oct和CA4-Oct的可编程组装，作者接下来分别用Cy3标记的Oct-12H、Cy3标记的Oct-24H和Cy5标记的CA4-FS研究了CA4-Oct的荧光共振能量转移（FRET）效应。正如预期的那样，hCA4-Oct和CA4-Oct均显示出明显的FRET信号。八面体水动力尺寸为17.0±1.1nm，功能Oct-12H和Oct-24H的水动力尺寸分别为24.9±3.0和26.5±3.4nm。hCA4-Oct的大小为29.5±3.2nm，CA4-Oct的大小为30.1±3.7nm（图1d）。AFM成像也证实了hCA4-Oct和CA4-Oct的形成。这一结果表明CA4-FS指向DNA八面体核的外侧，形成三层核-壳纳米组装体。上述结果证明了在DNA八面体上可以地装载多个游离药物分子。

2.细胞内化与肿瘤球体穿透

为了最大限度地负载CA4-FS，接下来的研究选择了一个完全负载CA4修饰的DNA八面体。图2a，b结果证明了通过修饰DNA纳米结构上的适配体增强了细胞内化。竞争性阻断实验也支持了这一结论。CA4-Oct的位移大于CA4-FS。基于上述结果，作者推断，内化增强的因素有：（i）识别单元增加（24 CA4-FS vs 1 CA4-FS）；（ii）八面体结构的刚度；（iii）提高CA4-Oct的稳定性。对于稳定性因子的重要作用，作者测试了CA4-Oct和CA4-FS在10%胎牛血清中的生物稳定性。8小时处理后，CA4-Oct保持不变，但55%的CA4-FS被降解。所以CA4-Oct的内化速率比CA4-FS的内化速率要快（图2b）。CA4-Oct和CA4-FS在无FBS培养基中保持了相同的完整性，表现出了相同的时间依赖性内化速率，进一步说明了至关重要的稳定因子减缓了CA4-FS的时间依赖性内化。

为了研究细胞选择性，作者还检测了PTK7阴性的NCM460细胞（正常结直肠细胞系）。与NCM460细胞相比，CA4-Oct和CA4-FS对HCT116细胞的吸收更多（图2c）。值得注意的是，与单链CA4-FS相比，CA4-Oct对HCT116细胞和NCM460细胞间CA4传递的细胞内化选择性要大得多（图2d）。可视化共聚焦成像也证实了上述发现。这些结果表明CA4-Oct比单链CA4-FS具有更多的细胞内化和选择性。为研究CA4在实体肿瘤组织中的递送深度，制备HCT116三维多细胞肿瘤球形体。与单链CA4-FS相比，CA4-Oct在肿瘤球状体中心有更高的强度（图2e）。这些发现支持了适配体壳由于其识别和结合作用而起主导作用的假说，以及DNA八面体核促进CA4-FS在肿瘤组织中的插入。

图2

3.靶向性细胞毒性和稳定性

在鉴定了CA4-Oct的细胞内化和穿透能力后，作者测定了其对目标癌细胞的细胞毒性。为了研究适配体介导的靶向给药的影响，作者选择了8h的短期孵育和40h的额外孵育，将抗癌功能从非特异性细胞吸附和核溶解中分离出来。作者发现，对照组Sgc8c、Lib、CA4-Lib、DNA八面体和CA4-Lib-Oct对HCT116细胞没有或可忽略的细胞毒性（图3a）。正如预期的那样，CA4-Oct比CA4-FS对HCT116细胞表现出更高的抑制细胞毒性。为了进一步强调CA4-Oct的细胞特异性毒性，作者还比较了对HCT116和NCM460细胞的毒性。如图3a所示，在孵育48小时后（预处理8小时后洗），除CA4外，所有组对NCM460细胞都没有表现出或可以忽略不计的细胞毒性。基于这些结果，CA4-Oct通过包裹CA4-FS表现出对肿瘤细胞的选择性，从而表现出选择性细胞毒性。

接下来，作者将培养时间增加到48小时，以评估DNA序列潜在的不稳定性介导的降解所导致的脱靶风险的可能性。基于图3a研究结果，作者认为显著提高CA4-Oct的核酸酶抗性可以显著缓解单价CA4-FS的脱靶效应，从而获得更好的安全性。

为了进一步系统地揭示CA4-Oct的靶向细胞毒性，作者构建了细胞共培养系统，模拟药物对体内多细胞共存环境的现实影响。在本研究中分别用CA4-Oct或CA4-FS处理转染了GFP的HCT116（GFP阳性）和NCM460（GFP阴性）的共培养体系（1:1，Q3/Q4，图3b）。在未经任何处理的孵育4h后，由于癌细胞的恶性增殖，活癌细胞与正常活细胞的比率（RCN）约为2:1（图3c）。短期治疗（8h冲洗后），CA4-Oct组RCN变为1:4，CA4-FS组RCN仅为1:2（图3d，e）。除抑制增殖外，CA4-Oct杀死约60%的HCT116细胞，而CA4-FS仅杀死45%（(Q2/（Q2+Q3)，图3d，e）。同时，CA4-FS和CA4-Oct导致正常细胞凋亡率较低（Q1/(Q1+Q4)，图3d，e）。在长期治疗（不洗涤）中，CA4-FS杀死了52%的NCM460细胞，尽管它诱导了71%的HCT116细胞凋亡（图3g）。然而，CA4-Oct也能杀死71%的HCT116细胞，但仅能引起28%的NCM460细胞凋亡（图3f）。因此，CA4-FS和CA4-Oct的RCNs分别约为1:3和1:5。显然，由于细胞外血清稳定性的差异，CA4-FS的脱靶不良反应比CA4-Oct严重的多。这些结果表明，DNA八面体增强了肿瘤细胞的靶向细胞毒性，降低了正常细胞的不稳定性介导的脱靶风险。

图3

4.活体成像分析

在良好的体外表现的鼓舞下，作者实施了体内评估。首先，将Cy5标记的CA4-Oct、Cy5标记的CA4-FS和游离的Cy5分别静脉注射到SD大鼠，通过追踪眼眶静脉血荧光信号来评价它们的药代动力学。补充实验结果支持Cy5在体内实验中未出现超出说明以外的实验现象，携带CA4的CA4-Oct比单链CA4-FS的血液浓度和循环时间要高得多。

CA4-FS组在注射后4和8小时肿瘤部位显示出更亮的Cy5信号，但在注射后12小时显示出非常微弱的荧光信号（图4a）。但CA4-Oct组在注射后第1天荧光信号仍然很亮。同时处死小鼠进行离体分析，评价其生物分布。静脉给药后12h，Cy5和CA4-FS主要分布在肾脏，而CA4-Oct在肿瘤部位表现出超过24h的强烈荧光信号（图4b）。

为了进一步确定CA4-Oct在实体瘤组织中是否具有优越的聚集能力和穿透能力，作者收集CA4-Oct组和CA4-FS组的肿瘤组织进行切片分析。CA4-Oct组在各实验时间点的Cy5信号均比CA4-FS组更亮（图4c，d），说明CA4-Oct具有更强的聚集能力，能够将更多的CA4药物传递到肿瘤组织。从CA4-FS与FITC标记的血管生物标志物CD31共定位结果来看，CA4-FS大多数分布在肿瘤血管内部或周围（图4d）。相比之下，大多数CA4-Oct穿过肿瘤血管，到达肿瘤组织（图4c），这将有利于深部给药。多价、致密、刚性的CA4-Oct确实增强了单链CA4-FS的穿透能力及其在实体肿瘤组织中的治疗潜力。

图4

互联网

喜欢作者我要约稿

喜欢作者

打赏方式

文献解读|分层组装的DNA线框纳米结构，可用于...（二）

周锦帆