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Nat Com | 基于O-link平台的血浆蛋白质组学揭示儿童多系统炎症综合征致病机理

鹿明生物

2022.2.17

● 前言

2021年12月美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院费城儿童医院儿科肿瘤科David T. Teachey教授课题组在Nature communication发表了题为“Proteomic profiling of MIS-C patients indicates heterogeneity relating to interferon gamma dysregulation and vascular endothelial dysfunction”的研究成果，通过基于Olink平台的蛋白质组学、流式细胞分选等研究方法，从MIS-C疾病的两个重要方面着手，探究了细胞因子产生过多和血管内皮功能障碍机理，为该疾病诊治的科学性提供了理论依据。

中文标题：MIS-C患者的蛋白质组学分析显示干扰素γ失调和血管内皮功能障碍相关的异质性

研究对象：多系统炎症患儿（MIS-C）

发表期刊：Nat communication

影响因子：14.919

发表时间：2021年12月

合作单位：美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院费城儿童医院

运用生物技术：基于Olink蛋白质组学、流式细胞术

● 研究背景

2020年，儿童全身炎症综合征(MIS-C)成为感染SARS-CoV-2后的主要儿科并发症，常表现为发热以及炎症，仅进行静脉注射免疫球蛋白治疗时往往效果欠佳，具体的致病机理也待考究。

休克是MIS-C患儿的显著特征，同时严重MIS-C和SARS-CoV-2的感染均能成为细胞因子风暴的潜在驱动因素。使用托珠单抗或阿那白滞素等药物能在一定程度上阻断细胞因子失调，但是，最佳靶向药物尚未确定。深入了解这些患者的细胞因子如何失调对于确定合理的靶向治疗至关重要。

除休克和炎症以外，血栓性微血管病（TMA）的风险也会在MIS-C和感染SARS-CoV-2患儿中升高。但MIS-C中TMA的致病机制与细胞因子失调的关联仍不清楚。

● 研究思路

● 研究结果

1. 感染SARS-CoV-2和MIS-C患儿血浆蛋白质组的整体情况说明

利用88名患者血浆，采用Olink Explore 1536/384 panel平台进蛋白质组学研究，20名患者（MIS-C，N=8，重症COVID19，N = 6，轻症SARS-CoV-2感染，N = 6）（样本策略）的流式数据于Vella等人已报道的文献中摘出。通过对数据进行无偏倚的t分布随机邻域嵌入（tSNE）可视化分析（图1），MIS-C 患者与急性 SARS-CoV-2患者或健康患者的聚类不同。原有文献证明MIS-C与CD8+ T细胞和Tbet+浆母细胞活化有关。但将该数据与蛋白质组学数据叠加后发现MIS-C 簇内活化的CD8+ T细胞百分比和Tbet+浆母细胞百分比却存在异质性。

图1 | Olink血浆蛋白组研究

与健康对照组 (N = 25) 相比，MIS-C (N = 22)、轻症 (N = 26)和重症(N = 15)血浆蛋白质组的总体情况说明

2.描绘MIS-C和SARS-CoV-2感染患者的激活途径

使用差异表达蛋白质（DEP）来描述MIS-C、轻症和重症与健康患者之间的差异。值得注意的是，与健康患者相比，PLA2G2A在所有三组之间均展示很大差异，其中最显著的差异发生在 MIS-C 患者与健康对照间。为了确定与 MIS-C 和COVID-19患儿的致病机理相关通路，使用 pathfindR对蛋白质-蛋白质相互作用进行了分析（图2a-c）。在感染SARSCoV-2 的所有分类中，细胞因子-细胞因子和趋化因子-细胞因子受体通路均失调。值得注意的是，与健康对照相比，MIS-C、轻症和重症患者的类似途径受到干扰。重症中的大多数 DEP 在 MIS-C 中也有差异表达，直接评估了这些组之间的 DEP，差异非常小。

图2 |与健康对照相比，每种疾病状态的差异表达蛋白质和通路分析

a) MIS-C (N = 22) 和健康对照 (N = 25) 患者之间的差异表达蛋白 (DEP，同时满足筛选条件log2>2，FDR<0.01)，以及通路分析排序（点的大小代表富集基因的数量，颜色的强度代表与富集分析相关的 p值）

b) 与健康对照组 (N = 25) 相比，轻症（N = 26) 的患者的 DEP 和通路分析排序

c) 与健康对照组 (N = 25) 相比，重症（ N = 15) 患者的 DEP 和通路分析排序

d) MIS-C（N = 22）患者和健康对照之间所涉及通路的网络分析，其中上调的蛋白质显示为红色，下调的蛋白质显示为橙色。通路项的节点大小代表通路中涉及的输入蛋白的数量。

3. MIS-C 的特点是对干扰素 γ 的反应不成比例

重症和MIS-C患儿的 IFNγ 水平都很高，无法根据IFNγ 水平将两组区分开，但是IL-10 可以。为了更好地理解这两种细胞因子，作者研究了 IFNγ 和 IL-10 之间的相关性及其模式反应蛋白和负责其产生的细胞群的相关蛋白。

作者检测了CXCL9作为与IFNγ 反应相关的关键蛋白，发现所有感染 SARS-CoV-2 的患者都显示 CXCL9 和 IFNγ 呈正相关。引人注目的是，与其他组相比，MIS-C 患者对 IFNγ 的 CXCL9 反应异常高。为了探究 IFNγ 产生的来源，将 IFNγ 水平与活化 T 细胞 (IL2RA)、NK 细胞 (NCR1) 和巨噬细胞 (CD163) 的可溶性标志物相关联。MIS-C 患者的 IFNγ 水平与 IL2RA 和 NCR1 显著相关，但与 CD163 无关，表明 IFNγ 水平与 T 细胞和 NK 细胞相关，但与巨噬细胞无关（图3a）。

MIS-C 患者的 IL-10 水平显著高于重症患者，其模式受体IL12B应该被 IL10所抑制。在 MIS-C 患者中，IL12B 与 IL-10 呈负相关，但在轻度、重度或健康患者中不相关。由此可证明，IL-10 的产生与活化的 T 细胞和巨噬细胞的标志物显著相关，但与 NK 细胞无关（图3b）。

作者随后从流式数据中检查了 IFNγ、CXCL9 和 IL-10 与活化的 CD8+ 和 CD4+ T 细胞之间的关系，以进一步探讨这些相关性（图3c、d）。作者发现 CXCL9 与这两种细胞类型显著且强烈相关，但 IFNγ 则不然。IL-10 与活化的CD4+细胞显著相关。

图3 | IFNγ 和 IL-10 反应和相关的细胞类型

a) MIS-C（N = 22)，与健康对照（N = 25），轻症感染（N = 26），COVID-19（N = 15）相比，IFNγ 信号传导与其模式反应蛋白 (CXCL9) 以及与活化 T 细胞 (IL2RA)、NK 细胞 (NCR1) 和巨噬细胞 (CD163) 相关的蛋白质之间的 Spearman 相关性

b) IL-10 与其经典受体 IL12B 以及每种疾病类别的 IL2RA、NCR1 和 CD163 之间的相关性

c) HLADR+CD38+ CD8+ T 细胞 (N = 19) 与 IFNγ、CXCL9 和 IL-10 之间的相关性

d) HLADR+CD38+ CD4+ T 细胞 (N = 19) 与 IFNγ、CXCL9 和 IL-10 之间的相关性

4. MIS-C 患者具有以 IFNγ 和 CXCL9 信号传导为特征的 MAS 样表型

MIS-C 患者对 IFNγ 的过度反应和过度表达的 CXCL9 可诱发巨噬细胞活化综合征 (MAS)。MAS 是一种高炎症状态，发生在风湿病、感染或作为原发性疾病的情况下，其特征是淋巴细胞和巨噬细胞在IFNγ 产生的情况下过度活化。作者研究了 IFNγ、CXCL9 和其他与 MAS 相关的标志物是否可以区分不同的感染SARS-CoV-2 结果。无监督的层次聚类显示了两组不同的 MIS-C 患者，它们的大多数 MAS 标志物都有升高。这两个簇的主要区别在于它们的 IFNγ 表达，其中 IFNγ 高组与 IFNγ 低组表现明显（图 4a）。CD163、CXCL9、IFNγ、IL2RA 和 VSIG4 在符合 MAS 标准的患者中显著升高（图 4b），并且发现符合 MAS 标准的患者入院期间的最大铁蛋白显著高于不符合 MAS 标准的患者，但疾病组之间没有显著差异（图 4c，d）。在急性期和恢复期样本的 MIS-C 患者中（N = 12），IFNγ、CXCL9 和 IL2RA 均随时间显著降低（图 4e）。

MAS 通常与血细胞减少有关，包括中性粒细胞减少。相比之下，MIS-C 的特征是显著的中性粒细胞增多，并且在符合 MAS 标准的患者中，绝对中性粒细胞计数 (ANC) 偏高是十分明确的（图 4f）。MIS-C 患者的 ANC 显著高于重度或轻度患者（图 4g）。在 MIS-C 患者中，中性粒细胞增多与 IFNγ 或 CXCL9 无关，但与 CD163 密切相关，这意味着这些患者的中性粒细胞增多与巨噬细胞活化有关（图 4h），但与 IFNγ或 CXCL9没有直接关系。

图4 | 与 MAS 和 MIS-C 和 SARS-CoV-2 感染患者的关联

a) MAS 相关蛋白 IFNγ、CXCL9、CD163、IL2RA、VSIG4 和 HMOX1 热图，无监督层次聚类(N = 88)

b) 符合 MAS 标准的患者 (N = 17) 和不符合 (N = 23) 标准的患者的 MAS 相关蛋白水平箱线图

c) 符合 MAS 标准的患者 (N = 17) 和不符合 (N = 23) 标准的患者入院期间的log2 转化后最大铁蛋白中位数箱线图

d) MIS-C (N = 21)、重症 (N = 13) 和轻症 (N = 6) 患者，log2 转化后入院期间最大铁蛋白中位数箱线图

e) 急性和恢复期样本的 MIS-C 患者的每种 MAS 相关蛋白的急性期和恢复期水平（N = 12）

f) 符合 MAS 标准的患者 (N = 17) 和不符合 (N = 23) 标准的患者的入院期间最大绝对中性粒细胞计数

g) MIS-C (N = 22)、重症 (N = 15) 和轻症 (N = 26) 患者入院期间的最大绝对中性粒细胞计数

h) 入院期间最大绝对中性粒细胞计数与 IFNγ、CXCL9 和 CD163 相关

5. PLA2G2A是与血栓性微血管病表型相关的MIS-C候选生物标志物

已有文献报道，SARS-CoV-2感染与临床TMA和TMA生物标志物SC5b9升高有关。由于 SC5b9 不包括在 Olink蛋白质组学分析中，将实验室测量的 SC5b9 水平（N = 75）与血管或血小板功能障碍相关的 Olink 蛋白相关联，以识别替代生物标志物。分层聚类确定 SC5b9 与 PLA2G2A、 PDGFC、 SELE、 CALCA、NOS3、VWA1和TYMP相关性最高（图5a）。作者评估了与 SC5b9 高度相关的蛋白质是否能够识别疾病类别（图5b）。MIS-C 患者由于非常高的 PLA2G2A 表达和中度的 CALCA 和 TYMP 表达而聚集。MIS-C 和重症患者之间的 PLA2G2A 和 CALCA 均显著升高。SARS-CoV-2 感染患者的 PLA2G2A 显著高于健康患者，MIS-C 患者差异最显著（图5c）。在MIS-C患者中，PLA2G2A、SELE、 CALCA 和 VWA1 在急性期和恢复期之间都有所改善（图5d）。值得注意的是，PLA2G2A的水平在恢复期并没有完全恢复到正常水平。

满足 TMA 标准与更高的 PLA2G2A 和 CALCA 显著相关（图5e）。与不符合 TMA 标准的患者相比，符合 TMA 标准的患者在入院期间更可能需要正性肌力药（N = 34）。鉴于之前假设 PLA2G2A 是 TMA 和微血管病性溶血性贫血的标志物，作者检查了 PLA2G2A 水平是否与入院期间的最低血小板计数和最低血红蛋白相关。PLA2G2A 水平与血小板和血红蛋白呈负相关，并按疾病类别分组（图5f）。

图5 | MIS-C 和 SARS-CoV-2 感染患者血栓性微血管病和血管内皮功能障碍的证据

a) 血管和血小板相关蛋白与SC5B9的相关矩阵 (N = 75)

b) 与 SC5B9 相关的候选替代标记的热图，包括 PLA2G2A、PDGFC、SELE、CALCA、NOS3、VWA1 和 TYMP（N = 88）

c) 每个 SC5B9 相关蛋白在疾病状态下的箱线图（MIS-C N = 22，重症 N = 15，轻症N = 26，健康 N = 25）

d) 急性和恢复期样本的 MIS-C 患者的每种 SC5B9 相关蛋白的急性期和恢复期水平（N = 12）

e) 符合（N = 13）且不符合血栓性微血管病标准（TMA；N = 21）的患者的 SC5B9 相关蛋白水平箱线图

f) 入院期间最低血小板计数和最低血红蛋白与PLA2G2A的相关性（MIS-C N = 22，重症 N = 15，轻症N = 26，健康 N = 25）

6. MIS-C患者的临床异质性

接下来，作者研究了 MAS 和 TMA 表型与 MIS-C 之间的重叠部分。在所有可用数据用于分析 MAS 和 TMA 的患者中，观察与 MIS-C 的交叉部分（N = 21）。在 MIS-C 患者（N = 15）中，TMA 和 MAS 无重叠（图6a）。为了进一步探索 MIS-C 患者之间的异质性，作者比较了来自图 4a 中确定的 IFNγ-高（N = 7）和 IFNγ-低（N = 13）集群的患者，并观察了这两个簇之间的 DEP，进行通路和聚类分析，表明细胞因子信号传导的差异，包括 IL-17 通路。IL-17 是一种中性粒细胞趋化因子，可能与这些患者的中性粒细胞增多有关（图6b-d）。高 IFNγ 的 MIS-C 患者具有显著更高的铁蛋白（图6e）。IFNγ 状态与纤维蛋白原、二聚体、血小板、血红蛋白或 ANC 无关。

为了了解 IFNγ 与 MIS-C 临床结果之间的关系，作者使用对正性肌力药的需求量作为严重程度的替代指标。发现与低IFNγ集群中的患者相比，高 IFNγ 集群中的患者需要正性肌力药的可能性更低（图6f），这意味着更高水平的 IFNγ 与 MIS-C 患者的病情较轻有关。NTproBNP 是与心脏损伤相关的标志物，显示出类似的趋势（图6g）。作者对所有MIS-C 患者进行了这项分析，发现需要正性肌力药的患者 NTproBNP 水平较高（图 6h）。因此，较高水平的 IFNγ 可能与 MIS-C 患者的病情较轻有关。

在 MIS-C 患者中，CX3CR1+ CD8+ T 细胞和 IFNγ 的激活呈负相关（图6i）。然而，CX3CR1 配体 CX3CL1 的水平与 CX3CR1+ CD8+ T 细胞活化无关（图6i）。在作者的无偏网络分析（图6d）中，将 CX3CL1 鉴定为富集蛋白（图6c），并观察到升高的 CX3CL1 和高 IFNγ 患者之间的关联，证明一组使用正性肌力药的患者风险较低（图6j）。数据表明血浆中的游离 CX3CL1 水平与 CX3CR1+ CD8+ T 细胞活化的频率无关（图6i），这解释了它们与正性肌力药需求的不同关联。因此，作者证明具有高 IFNγ 水平的患者不太可能需要使用正性肌力药，且较低水平的 CX3CR1+ CD8+ T 细胞活化。

图6 | MIS-C 患者的临床异质性由其 IFNγ 特征定义

a) 符合巨噬细胞活化综合征 (MAS)、血栓性微血管病 (TMA) 和 MIS-C 标准的患者之间的重叠

b) IFNγ 低（N = 13）和 IFNγ 高（N = 7）患者之间的差异表达蛋白质

c-d) IFNγ 低（N = 12）和 IFNγ 高（N = 7）组患者之间差异表达蛋白的无监督通路排序和网络分析

a) IFNγ 低和 IFNγ 高组患者入院期间的最大铁蛋白水平

b) 需要和不需要正性肌力支持的 IFNγ 低（N = 13）和 IFNγ 高（N = 7）组的患者人数

c) 在 MIS-C 患者中（N = 7）并且不需要正性肌力药

d) 在 MIS-C 患者中（N = 15）并且不需要正性肌力药

e) MIS-C 患者中 IFNγ 水平与 DR+CD38+ 非初始 CD8+ CX3CR1+ T 细胞百分比之间的相关性（N = 7）

f) IFNγ 低（N = 13）和 IFNγ 高（N = 7）患者之间的 CX3CL1 水平

● 研究结论

通过对MIS-C，轻症SRAS-CoV-2感染者，重症COVID19患者以及健康对照之间的蛋白质组学差异蛋白和流式数据综合分析，作者逐步明晰与 MIS-C 相关的复杂和异质的病理生理学。并确定TMA的重要生物标志物PLA2G2A，同时是MIS-C 的候选生物标志物。PLA2G2A在几乎所有 MIS-C 患者的水平都显著升高，并可区分 MIS-C 患者与其他 SARS-CoV-2 感染患者。

同时，作者发现一部分 MIS-C 患者符合 IFNγ 相关综合征 MAS的判定标准。但发现 IFNγ 高的患者可能不太需要正性肌力药，这一结果与其他与 IFNγ 产生失调相关的疾病不一致。MIS-C 患者表现出基于 IFNγ 表达的异质性。

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参考文献

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4. Feldstein, L. R. et al. Multisystem inflammatory syndrome in U.S. children and adolescents. N. Engl. J. Med. 383, 334–346 (2020).

5. Consiglio, C. R. et al. The immunology of multisystem inflammatory syndrome in children with COVID-19. Cell 183, 968–981.e967 (2020).

文末看点｜lumingbio

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