一文知晓PCR，定量PCR与数字PCR的实验方法与选择（一）
从1985年至今的30多年时间里，PCR分析经历了三代技术的发展。第一代传统PCR技术，采用琼脂糖凝胶电泳的方法对PCR产物进行定性分析。第二代荧光定量PCR技术，通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控PCR进程，最后用Cq值对基因进行定量分析。第三代数字PCR技术，通过将PCR反应液进行有限稀释，实现核酸分子的单分子扩增，最终采取终点法检测阳性微滴的荧光信号，有荧光信号的微滴判读为 1；没有荧光信号的微滴判读为 0，因此该技术被称为数字PCR。
PCR技术在不断地蜕变却从未淡出我们的视野，如今已经渗透到分子生物学领域的各种研究层面。尤其在今年全球大流行疾病中，展现了PCR技术的强大之处。那在科学研究中，我们该如何选择传统PCR 、荧光定量 PCR与数字 PCR呢？
首先我们要清楚，三代PCR技术所有的基础源于PCR反应的基本原理和PCR反应的3个重要阶段，分别是指数期、线性期和平台期。
指数期
指数期内，每个循环PCR产物量大约增加1倍（假定 100%反应效率），该阶段的扩增反应具有高度特异性和精确度。
线性期（高变异性）
随着PCR反应体系成分的消耗，其中的一个或者多种成分限制反应，导致反应开始减缓，并且每个循环的PCR 产物不再加倍。
平台期
反应停止，不再产生更多的产物。因为每个样品具有不同的反应动力学，所以每个反应将在不同的时间点进入平台期，平台期内可以看到这些差异。
传统 PCR
传统PCR通过琼脂糖凝胶电泳对PCR终产物进行分析（图2），它的局限性就在于只能做定性分析。在图3中，3个反应孔含有相同量的 DNA模板，但到达平台期后产生的荧光信号却不同，说明扩增产物的量存在不同（反应动力学变化所致）。这也表明了传统PCR平台期测量时结果存在变异，产出的DNA量不一定能反映最初情况，所以无法进行定量。
荧光定量 PCR
同样在图3中，发现在指数期内，3个反应孔的扩增曲线完全重合，说明指数期内进行检测将更加精确，可实现更加准确的定量。阈值线是扩增产物荧光强度超过背景时的一个荧光强度值，样品达到此荧光强度值所经过的循环数称为Cq值。通过比较未知浓度的样品与一系列标准品的Cq值，可以精确测定未知反应中的模板 DNA数量。
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