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Real time PCR试剂质量的评价

2019.7.29

临床使用PCR定量检测核酸，由于手工操作多、影响因素多，质量控制比较困难，在增强操作能力和仪器设备的基础上，选择好的PCR试剂是保证检测质量非常重要的关键。

一、通过实时荧光PCR扩增曲线评价【扩增曲线图解读】实时荧光PCR由于每个循环要监测荧光信号值，因此都有拟合好的扩增曲线，通过扩增曲线可以很直观、准确的了解和评判试剂质量的好坏。认真研究扩增曲线图可以看出非常多的问题，基本上可以判定试剂的质量。下图是一张非常漂亮的扩增曲线图：从上图可以看出几个问题：1. 总体看曲线拐点清楚，指数期明显，扩增曲线整体平行性极好，基线平无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。2. 曲线指数期斜率，反应了扩增效率，越大说明扩增效率越高。扩增效率越高，试剂灵敏度表现会越好。3. 基线，图上的基线也就是阴性样本的扩增曲线，平直或略微下降是好试剂的表现，阴阳性清楚，不易误判。如果有上扬趋势，有可能造成阴性标本误判。4. 曲线与曲线间平行性非常好，说明各反应管扩增效率相近，外标准定量建立在每管扩增效率一样的假定基础上，所以扩增效率越相近，定量的重复性和准确性就越好。而扩增效率相近与否，反应在扩增曲线图上就是曲线的平行性。5. 低浓度曲线指数期明显，一方面不易出现假阴阳性误判，另一方面说明灵敏度高。【仪器差异】扩增曲线图与仪器的原理和性能有很大关系，一方面仪器的原理决定了仪器的优缺点，另一方面仪器的的软件拟合方式不同也决定了仪器曲线图的不同，因此只有同一种仪器的扩增曲线图才能反应和比较试剂的质量。下图是同一种试剂在不同仪器上的扩增曲线图：1．由于仪器检测原理不同，拟合方式不同，因此不能用不同仪器间的斜率来判断扩增效率的好与坏。2．但从各自曲线的平行性来看，5700的表现要弱于LC，这除了偶然误差外，与LC使用离心空气加热、所有管的温度一致而5700使用半导体加热，温度一致性要弱于LC有关。同时毛细管导管强与薄壁管也是一个影响因素。【比较试剂】使用扩增曲线图比较试剂一定要在同一仪器上，下图是三种试剂在5700上的扩增曲线：1．从上图可以看出前两种试剂表现比较好，而第三种试剂就明显质量差了很多。2．从基线看，第三种试剂基线上线，阴性结果易被误判。扩增效率低、且严重不一致，定量结果重复性和准确性肯定不好。低浓度表现不佳，灵敏度肯定会低。二、实验验证评估试剂质量指标由于PCR试剂是由提取和扩增两步进行的，扩增曲线能看出大部分问题，但不能看出全部问题。因此完善全面的评估还要专门进行实验设计来验证试剂质量的指标，同时设计实验后的扩增曲线也更能说明问题。【灵敏度】各厂家公布的灵敏度都差不多，但实际情况真是如此吗？这需要实验验证。比较灵敏度的高低，最好的办法就是使用一高浓度的标准，稀释成梯度系列，使用不同试剂同时去检测，看谁能检出的稀释度高，谁灵敏度好。除去偶然因素，结果一般都与扩增曲线的判断一致。【特异性】做非常多的阴性标本，看检测结果，与扩增曲线走势一致。【重复性】重复性有两种做好，一种是对同一标本进行多数检测(包括提取)，计算CV值，越小越好。别一种就是利用灵敏度的梯度曲线算线性，越近似于1越好。【其他】诸如稳定性实验等一般不是特别重要可以忽略。