Omega真菌RNA提取流程
实验概要
Omega真菌RNA提取试剂盒中文说明书(E.Z.N.A. Fungal RNA Kit)。
主要试剂
1. 取适量RB裂解液，按1ml裂解液加入20ul 2-疏基乙醇。该混合液可于室温放置一周。
2. 用DEPC水配置一小瓶70%乙醇。
3. 按下表用无水乙醇稀释RNA Wash Buffer II，并于室温保存。
R6840-00: 加入8ml无水乙醇
R6840-01: 加入48ml无水乙醇
R6840-02: 每瓶加入48ml无水乙醇
实验步骤
1. 称取50-100mg经液氮研磨成粉末状的真菌样品至1. 5ml离心管，立即加入500ul RB/2-Me, 剧烈涡旋。
2. 室温14,000×g离心5min，小心转移上清至匀浆柱中。14,000×g离心2min。
3. 转移收集管中的上清(注意不要吸到沉淀)至新离心管，加入0. 5倍体积无水乙醇或等体积的7 0 %乙醇，吸打或涡旋混匀。(一般可转移450ul的上清液，可加入225ul无水乙醇)。
4. 把RNA柱套在新收集管，转移混合液至RNA柱子。室温10,000×g离心30-60秒，弃去滤液。如果出现堵柱现象，提高离心速度至14, 000xg。
5. (可选)膜上DNase消化:
1) 加入300ul RNA Wash Buffer I至柱子中，按上柱条件离心，弃滤液；
2) 配制DNase消化液( Digestion Buffer，73.5ul；RNase-Free DNase I，1.5ul)，混匀。
3) 将上述消化液转移至柱子膜的正中央，不要将消化液转移至柱子内壁。
4) 室温静置15分钟。
6. 加入400ul RNA Wash Buffer I至柱子中，按以上条件离心，弃去滤液和收集管。
7. 把柱子套在新收集管，加入500ul RNA Wash Buffer II 至柱子，按以上条件离心弃去滤液。
8. 把柱子套回收集管，加入500ul RNA Wash Buffer II 至柱子，按以上条件离心弃去滤液。
9. 10,000xg离心空柱2min以上甩干柱子基质。
注意：不要忽略此步――这对从柱子上除去乙醇至关重要。
10. 把柱子装在干净的1.5ml离心管上，加入30- 50ul DEPC Water到柱子基质上室温静置2min。10,000xg离心2min洗脱出RNA。
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