总RNA提取与Northern杂交（3）
第二天：
将上述物品揭开，将胶正面朝下，膜正面朝上，用铅笔作好标记。
将胶浸泡在EB中1-2分钟，用DEPC H2O清洗，将膜放在滤纸上面，夹好，4度下保存，或者直接进行预杂交。
UV杂交（有助于RNA结合到膜上面）。
五、预杂交和杂交
预杂交和杂交 buffer： 100ul
20×SSC 25ml （5×SSC）
甲酰胺 50ml （50%）
N-lauroylsarcosine： 0.1g（0.1%）
20% SDS 100ul（0.02%）
blocking reagent 2g（2%）
DEPC H2O 25ml
（一）预杂交：
预杂交buffer 在55-65度下加热，温度取决于探针的质量。如果温度低，则会得到更多非特意的条带：对于周探针较好。如果温度高，则会得到高结合力的条带：探针较好。
把膜装进一个塑料袋中，RNA在一边，密封。
在预杂交buffer中培养，55-65度，轻摇，过夜。越长越好。但是要确保溶液盖到膜。
（二）杂交：
buffer 在55-65度下加热，弃去塑料袋中的预杂交buffer，将探针buffer装进，55-65度下培养过夜，轻摇。
注意：预杂交和杂交都是在同一温度下进行。
杂交后：
1、 清洗：室温下用2×SSC，0.1%SDS清洗，5分钟，2次。
2×SSC， 0.1%SDS
10 ml 20×SSC
500ul 20%SDS
加DEPC H2O 至100 ml
2、 清洗： 55-65度，用0.1-0.5 SSC清洗2次，每次15分钟。
SSC buffer 的浓度、温度取决于探针的质量。浓度越低、温度越高，则会得到更高的效果。
Buffer在使用之前要先加热。
3、清洗
室温下用1×MA-T清洗，1分钟，1次。
1×MA-T
100ml 10×MA
900ml DEPC H2O
3ml Tween 20 （占总的0。3%）
10×MA（室温下储存）
1M 顺丁烯二醛
1.5M NaCl
不容易溶解，可以加入70gNaOH 调节到1L。并且调节PH=7。5
4、阻断：
室温下blocking buffer，30 min
blocking buffer
1g 阻断剂
100ml 1×MA-T
稍微加热充分溶解。
5、DIG- Ab
室温下用Ab- blocking buffer，30 min
Ab ：blocking buffer= 1：5，000
重要：抗体离心后取出上清液
6、清洗
室温下用1×MA-T清洗，15分钟，2次。
7、检测
（1）将膜用 detection buffer 培养2-3分钟，即清洗一遍。
detection buffer
100mM Tris-HCL
100Mm NaCl
PH=9.5
（2）将膜取出，置于塑料薄膜上。
（3）用适量的CDP-Star（约1毫升），将膜均匀润湿，涂匀，将塑料薄膜合上，中间不能有空气和皱折。 等待5分钟。
（4）用吸水纸将膜边缘的CDP-Star吸去，用热将塑料薄膜密封。
（5）检测（暗室操作，去校医院放射科）。
（6）分析统计。
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