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哺乳动物细胞瞬时基因转移法制备重组蛋白实验

2019.3.29

报道显 TK，在过去的 1 0 年，已经开发出了多种高效的瞬时转染（transient transfection) 方法，它们可以满足甚至超出了上述需求。目前蛋白质的瞬转表达主要是在H E K 2 9 3 衍生的细胞系中进行, 而同时研究人员也在努力发展针对 C H O 细胞的效率相当的方法。这有利于维持相同的宿主细胞背景，从而在治疗用蛋白质的整个研发过程中可以使产品的性质保持一致。有关当前 T G E 的详细总结可参考一些最近发

实验步骤	一、转染方法对于脂质体转染 (Upofection), 可以从商业途径获得许多配方，这些配方都具有单一的ZL化组分，而且毫无疑问，它们中的大部分都能非常有效地将质粒 D N A 转人细胞。其缺点是价格不菲—- 在使用这些试剂时，对于超出数百毫升规模的瞬时转染，经济上是不可行的。大规模的瞬时转染方法要求转染试剂能很容易大量获取, 批次间的变化小以保证转染的一致性。尽管也存在一些其他的选择，如将壳聚糖 (chitosan) 及其衍生物和14D E A 2 作为转染试剂（D a n g and L e o n g , 2006; Jiang and Sharfstein， 2008; K u s u m o t oet a L ， 2 〇〇 6)，但磷酸钙（calcium phosphate) 介导的转染以及基于聚乙烯亚胺 (polyethylenimine，PEI) 的质粒络合 (plasmidcomplexation) 和细胞摄人是仅有的满足这些要求的两种常用技术。 1.利用聚乙烯亚胺在 W a v e ™ 生物反应器中进行大规模瞬时转染近些年，一次性的 W a v e ™ 生物反应器得到了普遍的认可，因为相对于经典的搅拌釜反应器，其保养和操作更加容易。虽然 100 L 工作体积的反应器也实现了商业化，拥有300 L 工作体积的样机也在开发之中, 但最常用的反应器的工作体积是 10 L 和 20 L 。是否使用 W a v e ™ 生物反应器进行 10 L 以下的转染取决于经济可行性—我们更倾向于使用摇瓶进行小规模的生产 ( F e m b a c h flasks， Corning)。据报道，也有其他的反应器或振摇设备成功的用于瞬转培养（Muller et al. ， 2005; P h a m et aL , 2006; Stettler et al.，2007)。下面介绍以 H E K 293 T 细胞为宿主，使用 M 11V 3 无血清培养基 (Novartis proprietary) 进行 10 L 规模的抗体生产的方法。抗体的两条链都克隆至同一个表达载体。 (1) 将一个 20 L 的 W a v e ™ 袋（Sartorius Stedim Biotech, G 6ttingen， G e r m a n y ) 安装到 W a v e ™ 工作平台（W a v e - Bioreactor S P S 5O ) ，并连接到一个 D A S G I P 气体混合模块上（D A S G I P ， Juelich， G e r m a n y )。然后，在袋中接种 4 L H E K 293T 细胞培养物，细胞密度约为 I.8 X IO⁶ 个细胞/m L 。 (2) 我们采用了下列过程参数和条件 : 气体流速 2 〇 L /h ; 混合气体包括 2 1 % 〜2 5 % 〇 2、0 % C O 2; 温度 37°C ; p H 6. 8〜7, 4; 摇摆速率 10 r Z m i n; 摇摆角度 7° (3) 将 10 m g 质粒 D N A (1 m g /m L ) 与 M 11V 3 培养基混合至终体积为 500 m L , 室温孵育 10 m i n 。然后，用 0. 22 p m 的 G P E X P R E S S P L U S 滤膜（Millipore, Billerica, M A ) 将稀释后的 D N A 溶液过滤除菌。 ⑷ 将 3 〇 m L P E I 溶液（I m g /m L ) 与 500 m L M l l V 3 培养基混合，室温孵育10 m i n 。然后用 0.22um 的 G P E X P R E S S P L U S 滤膜将稀释后的 P E I 溶液过滤除菌。注意:P E I 储存液在使用前是应当无菌的，经过过滤的，分装并冻存于一 80°C 直至使用。 (5) 接下来，将 P E I 溶液加至 D N A 溶液中，室温孵育 15 m i n 以形成多聚络合物。 (6) 无菌条件下，将 D N A -P E I -M 11V 3 混合物加至 W a v e ™ 袋中的细胞培养物中, 终体积为 5 L 。继续用下列参数孵育 5〜6 h : 气体流速 M L /h ; 混合气体包括 2 5 % O 2、〇 %CO₂; 温度 37°〇 ; 口 1^6.8〜7.4; 摇摆速率 1 〇 r/min; 摇摆角度 7°。 (7) 然后，向 5 L M 11V 3 培养基中补加 100 m L R X l 组合补料 (补料含有氨基酸、葡萄糖和谷氨酰胺；由 Irvine Scientific， Santa A n a , C A 定做），无菌条件下将其加至W a v e ™ 袋的细胞中。在生产期，采用如下参数 : 气体流速 30〜40 L /h ; 混合气体包括3 〇 %〜4 〇 % O 2、0 % C O 2; 温度 37°C ; p H 6. 8〜7.4(用 p H 9.2 的碳酸氢盐溶液调整，Sigm a Aldrich, B u c h s , Switzerland); 气体饱和度 6 0 % 〜100%; 摇摆速率 14〜18 r/mi. n ; 摇摆角度 7°。 (8) 转染的细胞在 W a v e ™ 生物反应器中培养 10 天，以生产抗体。注意 : 为了生产重组蛋白，生产期通常为 5〜7 天，但如果目标蛋白质对蛋白酶解敏感，这个时间可以缩短。抗体分子的生产时间可延长至 1 0 天。 (9) 每天取样，用 V 1 -Cell 细胞计数设备（B e c k m a n Coulter) 测定细胞密度和成活率。用 Bioprofile 400 分析仪 (Labor-Systeme Fliickiger, Switzerland) 测定营养状态、p H 及气体饱和度。用蛋白 A 高压液相测定 I g G 浓度（图 15. 1)。 (10) 10 天后，在无菌条件下收集细胞，横流过滤（cross-flow filtration) (FreseniusFilter P l a s m a F l u x， 0.2 fim) 以除去细胞。然后将无细胞的上清液用中空纤维过滤(hollow fiber filtration)(H e m o f l o w F 10 H P S , Fresenius, Stans, Switzerland, 10 k D acutoff) 的方法浓缩 10 倍。 (11) 用 Protein A 亲和色谱和分子筛色谱对浓缩液进行纯化。对上述这些标准方法有多种改进, 这些改进后的方法已经经过测试并发表，其中的一些在下面简短列出。 ① 在利用 C H O 细胞系进行生产的过程中，通过转换温度至 30〜32°C 提高表达速率(Backliwal et al. ， 2008a ; Galbraith et al. ， 2006)。 ② 用微管解聚剂诺考达唑（nocodazole) 处理细胞使其细胞周期停滞在 G 2/M 期(Tait et a L ， 2004)。 ③ 用抑制剂，如丁酸钠（sodium butyrate)、丙戊酸（valproic acid) 处理去抑制 C H O和 H E K 293 细胞的组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase) 及 D N A 甲基转移酶（D N Amethyl transferase) (Backliwal et al. , 2008c)。 ④ 对细胞系进行遗传改造，以阻止凋亡 (apoptosis) 或克服未折叠蛋白质应答 (unfolded protein response,U P R ) 造成的抑制作用（Backliwal et al. , 2008c; Majors et al. ，2007； Tigges and Fussenegger, 2006) „ 结论正如该领域中已经发表的大量数据所反映的那样, 过去几年，就技术发展和产量而言，通过瞬时转染技术制备重组蛋白已经达到了一个令人印象深刻的状态。不过，尽管有报道指出，利用大规模瞬时转染技术在生物反应器中生产蛋白质，已能获得相当高的抗体滴度—大于 I g / W B a c k l i w a l et al. ， 2008a)，但现在就想用它替换过程繁琐的构建细胞系方法用于生物治疗药物的生产还为时尚早。我们通过对 1 〇〇多个瞬时转染表达实验的观察表明，对于不同的基因，表达量变动很大: 一般蛋白质的表达量从 I m g / L 到超过170 m g /L ; 抗体的平均表达量为 20〜40 m g /L ，但常常分布在两个极端。毫无疑问, 在表达载体设计、培养条件优化和可能的细胞系改造方面, 我们还需要进一步的技术改进, 但这种方法总体上令人印象深刻的成功证明了这种努力是值得的。展开

实验步骤

一、转染方法

对于脂质体转染 (Upofection), 可以从商业途径获得许多配方，这些配方都具有单一的ZL化组分，而且毫无疑问，它们中的大部分都能非常有效地将质粒 D N A 转人细胞。其缺点是价格不菲—- 在使用这些试剂时，对于超出数百毫升规模的瞬时转染，经济上是不可行的。大规模的瞬时转染方法要求转染试剂能很容易大量获取, 批次间的变化小以保证转染的一致性。尽管也存在一些其他的选择，如将壳聚糖 (chitosan) 及其衍生物和14D E A 2 作为转染试剂（D a n g and L e o n g , 2006; Jiang and Sharfstein， 2008; K u s u m o t oet a L ， 2 〇〇 6)，但磷酸钙（calcium phosphate) 介导的转染以及基于聚乙烯亚胺 (polyethylenimine，PEI) 的质粒络合 (plasmidcomplexation) 和细胞摄人是仅有的满足这些要求的两种常用技术。

1.利用聚乙烯亚胺在 W a v e ™ 生物反应器中进行大规模瞬时转染

近些年，一次性的 W a v e ™ 生物反应器得到了普遍的认可，因为相对于经典的搅拌釜反应器，其保养和操作更加容易。虽然 100 L 工作体积的反应器也实现了商业化，拥有300 L 工作体积的样机也在开发之中, 但最常用的反应器的工作体积是 10 L 和 20 L 。是否使用 W a v e ™ 生物反应器进行 10 L 以下的转染取决于经济可行性—我们更倾向于使
用摇瓶进行小规模的生产 ( F e m b a c h flasks， Corning)。据报道，也有其他的反应器或振摇设备成功的用于瞬转培养（Muller et al. ， 2005; P h a m et aL , 2006; Stettler et al.，2007)。

下面介绍以 H E K 293 T 细胞为宿主，使用 M 11V 3 无血清培养基 (Novartis proprietary) 进行 10 L 规模的抗体生产的方法。抗体的两条链都克隆至同一个表达载体。

(1) 将一个 20 L 的 W a v e ™ 袋（Sartorius Stedim Biotech, G 6ttingen， G e r m a n y ) 安装到 W a v e ™ 工作平台（W a v e - Bioreactor S P S 5O ) ，并连接到一个 D A S G I P 气体混合模块上（D A S G I P ， Juelich， G e r m a n y )。然后，在袋中接种 4 L H E K 293T 细胞培养物，细胞密度约为 I.8 X IO⁶ 个细胞/m L 。

(2) 我们采用了下列过程参数和条件 : 气体流速 2 〇 L /h ; 混合气体包括 2 1 % 〜2 5 % 〇 2、0 % C O 2; 温度 37°C ; p H 6. 8〜7, 4; 摇摆速率 10 r Z m i n; 摇摆角度 7°

(3) 将 10 m g 质粒 D N A (1 m g /m L ) 与 M 11V 3 培养基混合至终体积为 500 m L , 室温孵育 10 m i n 。然后，用 0. 22 p m 的 G P E X P R E S S P L U S 滤膜（Millipore, Billerica,
M A ) 将稀释后的 D N A 溶液过滤除菌。

⑷ 将 3 〇 m L P E I 溶液（I m g /m L ) 与 500 m L M l l V 3 培养基混合，室温孵育10 m i n 。然后用 0.22um 的 G P E X P R E S S P L U S 滤膜将稀释后的 P E I 溶液过滤除菌。

注意:P E I 储存液在使用前是应当无菌的，经过过滤的，分装并冻存于一 80°C 直至使用。

(5) 接下来，将 P E I 溶液加至 D N A 溶液中，室温孵育 15 m i n 以形成多聚络合物。

(6) 无菌条件下，将 D N A -P E I -M 11V 3 混合物加至 W a v e ™ 袋中的细胞培养物中, 终体积为 5 L 。继续用下列参数孵育 5〜6 h : 气体流速 M L /h ; 混合气体包括 2 5 % O 2、〇 %CO₂; 温度 37°〇 ; 口 1^6.8〜7.4; 摇摆速率 1 〇 r/min; 摇摆角度 7°。

(7) 然后，向 5 L M 11V 3 培养基中补加 100 m L R X l 组合补料 (补料含有氨基酸、葡萄糖和谷氨酰胺；由 Irvine Scientific， Santa A n a , C A 定做），无菌条件下将其加至W a v e ™ 袋的细胞中。在生产期，采用如下参数 : 气体流速 30〜40 L /h ; 混合气体包括3 〇 %〜4 〇 % O 2、0 % C O 2; 温度 37°C ; p H 6. 8〜7.4(用 p H 9.2 的碳酸氢盐溶液调整，Sigm a Aldrich, B u c h s , Switzerland); 气体饱和度 6 0 % 〜100%; 摇摆速率 14〜18 r/mi. n ; 摇摆角度 7°。

(8) 转染的细胞在 W a v e ™ 生物反应器中培养 10 天，以生产抗体。
注意 : 为了生产重组蛋白，生产期通常为 5〜7 天，但如果目标蛋白质对蛋白酶解敏感，这个时间可以缩短。抗体分子的生产时间可延长至 1 0 天。

(9) 每天取样，用 V 1 -Cell 细胞计数设备（B e c k m a n Coulter) 测定细胞密度和成活率。用 Bioprofile 400 分析仪 (Labor-Systeme Fliickiger, Switzerland) 测定营养状态、p H
及气体饱和度。用蛋白 A 高压液相测定 I g G 浓度（图 15. 1)。

(10) 10 天后，在无菌条件下收集细胞，横流过滤（cross-flow filtration) (FreseniusFilter P l a s m a F l u x， 0.2 fim) 以除去细胞。然后将无细胞的上清液用中空纤维过滤(hollow fiber filtration)(H e m o f l o w F 10 H P S , Fresenius, Stans, Switzerland, 10 k D acutoff) 的方法浓缩 10 倍。

(11) 用 Protein A 亲和色谱和分子筛色谱对浓缩液进行纯化。对上述这些标准方法有多种改进, 这些改进后的方法已经经过测试并发表，其中的一些在下面简短列出。

① 在利用 C H O 细胞系进行生产的过程中，通过转换温度至 30〜32°C 提高表达速率(Backliwal et al. ， 2008a ; Galbraith et al. ， 2006)。

② 用微管解聚剂诺考达唑（nocodazole) 处理细胞使其细胞周期停滞在 G 2/M 期(Tait et a L ， 2004)。

③ 用抑制剂，如丁酸钠（sodium butyrate)、丙戊酸（valproic acid) 处理去抑制 C H O和 H E K 293 细胞的组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase) 及 D N A 甲基转移酶（D N Amethyl transferase) (Backliwal et al. , 2008c)。

④ 对细胞系进行遗传改造，以阻止凋亡 (apoptosis) 或克服未折叠蛋白质应答 (unfolded protein response,U P R ) 造成的抑制作用（Backliwal et al. , 2008c; Majors et al. ，2007； Tigges and Fussenegger, 2006) „

结论

正如该领域中已经发表的大量数据所反映的那样, 过去几年，就技术发展和产量而言，通过瞬时转染技术制备重组蛋白已经达到了一个令人印象深刻的状态。不过，尽管有报道指出，利用大规模瞬时转染技术在生物反应器中生产蛋白质，已能获得相当高的抗体滴度—大于 I g / W B a c k l i w a l et al. ， 2008a)，但现在就想用它替换过程繁琐的构建细胞系方法用于生物治疗药物的生产还为时尚早。我们通过对 1 〇〇多个瞬时转染表达实验的观察表明，对于不同的基因，表达量变动很大: 一般蛋白质的表达量从 I m g / L 到超过170 m g /L ; 抗体的平均表达量为 20〜40 m g /L ，但常常分布在两个极端。毫无疑问, 在表达载体设计、培养条件优化和可能的细胞系改造方面, 我们还需要进一步的技术改进, 但这种方法总体上令人印象深刻的成功证明了这种努力是值得的。

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