双剑合璧，基于靶向蛋白质组学PRM技术分析蛋白复合物中的磷酸化修饰

精准医学与蛋白组学

2019.9.06

景杰学术/解读
蛋白主要通过结合在一起的复合物来调控生物学功能，而磷酸化修饰在调节蛋白质复合物的组装中起关键作用，因此分析蛋白复合物中的磷酸化动态变化，如EFG刺激条件下的磷酸化级联反应等信号通路，对于理解生理病理现象非常重要。

当下蛋白质组学发展如火如荼，在初期大规模组学筛选之后，验证的需求越来越多。特别是针对一些低丰度的磷酸化等翻译后修饰的检测，筛选阶段得到的结果经常评分较低，可靠性存疑。近些年来兴起的靶向蛋白质组学PRM因其高灵敏度、高重复性、高准确性等优势被广泛应用在多个研究领域。因此从理论上讲，凭借更高的灵敏度和特异性，PRM方法能够对大规模筛选结果中评分较低的蛋白修饰进行确证和补充。

今天介绍的这篇文章，发表在分析化学领域国际著名期刊Analytical Chemistry（IF:6.35）上，是运用靶向蛋白质组学PRM技术鉴定和定量蛋白复合物中磷酸化修饰的经典案例。中科院大连化学物理研究所叶明亮研究员团队通过基于高灵敏度PRM技术建立的分析流程，对EGF信号刺激条件下四个时间段的内源性Shc1蛋白复合物的磷酸化肽段进行鉴定及定量，共鉴定到82个磷酸位点。本文建立的PRM方法不仅在该蛋白复合物中鉴定出最多磷酸化位点，也为未来靶向蛋白质组学鉴定和定量磷酸化修饰研究提供新思路。

研究速读

1. 基于PRM技术分析Shc1蛋白质复合体磷酸化的pseudo-targeted策略

在EFG信号刺激条件下，为了鉴定更多Shc1蛋白复合物中的磷酸化修饰位点，作者利用PRM技术高灵敏度的优势建立了一种pseudo-targeted策略。该策略首先通过DDA的方法鉴定磷酸化修饰位点，在筛选出高可信度的数据后，将鉴定得分小于30的数据组成一个pseudo-targets，再利用PRM技术对pseudo-targets中潜在的磷酸化肽段进行验证，进而获得更多高可信度的磷酸化修饰位点。

图1. 基于PRM技术分析蛋白质复合体磷酸化的pseudo-targeted策略

2. pseudo-targeted策略提高谱图质量

在Shc1蛋白复合物中，作者筛选出152个score小于30的潜在磷酸化肽段并利用PRM技术对其进行验证，最终获得37个高可信度的磷酸化肽段。图2b中的实验数据显示，相同的磷酸化肽段在DDA模式下的谱图非常差（Mascot得分为6），但是在PRM模式下产生可信度非常高的谱图（Mascot得分为34）。因此，正是因为PRM模式下提高的谱图质量帮助作者鉴定到了更多的磷酸化修饰位点。

图2. pseudo-targeted策略提高谱图质量

3. DDA或PRM实验重复对修饰鉴定的覆盖率无显著影响

由于蛋白组的复杂性和DDA扫描模式的随机性，一般实验都会进行至少3次生物学或技术重复。为了进一步探究本文研究中多次实验重复对修饰鉴定深度的影响，作者对3次重复鉴定的磷酸化位点进行比较，结果表明多次DDA或PRM实验并没有显著影响修饰鉴定覆盖率。

图3. DDA或PRM实验重复对修饰鉴定的覆盖率无显著影响

4. 基于PRM技术定量分析EGF刺激后Shc1复合物的动态变化

为了更好的探究Shc1蛋白复合物在EGF刺激条件下的动态变化，作者选取了0min、2min、5min、20min四个时间段进行磷酸化修饰位点的分析并分别鉴定到10、57、63、63个磷酸化位点，累计共鉴定到82个unique磷酸化位点，为该复合物迄今报道最多。

图4. 基于PRM技术定量分析EGF刺激后Shc1复合物的动态变化

综上，研究者运用靶向蛋白质组学PRM技术实现了对蛋白复合物中磷酸化修饰的鉴定和定量。作者利用PRM技术高灵敏度的优势，建立了一种无需富集步骤来研究蛋白复合物磷酸化修饰的实验流程，操作简单，无需样品分级和富集。通过将DDA数据中鉴定的低丰度肽段构建一个“pseudo-targeted”列表并利用PRM技术来鉴定新的高可信度的磷酸化修饰位点。研究者利用该思路建立的pseudo-targeted 质谱方法对EGF信号刺激四个阶段中Shc1蛋白复合物的磷酸化修饰进行研究，最后共鉴定到82个磷酸化位点，为该复合物迄今报道最多。

本篇研究利用PRM技术建立的pseudo-targeted 质谱方法，可以成为磷酸化修饰鉴定的有力工具，也为将来靶向蛋白质组学鉴定和定量蛋白复合物的磷酸化修饰研究提供新思路。

参考文献：Jiawen Lyu, et al. (2018) pseudo-targeted MS method for the sensitive analysis of protein phosphorylation in protein complexes. Analytical Chemistry.本文由景杰学术团队原创，欢迎转发到朋友圈。如有转载、投稿、等其他合作需求，请添加微信ptm-market咨询。