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项目文章PBP | 浙江工业大学傅正伟运用GC-MS非靶向代谢组学和16S探究水稻根际微生物群落影响

鹿明生物

2020.9.07

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鹿明

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前言

环境管理需要更好地了解植物生理和微生物等对地球化学循环的相互作用。本篇由欧易/鹿明合作客户浙江工业大学傅正伟教授团队发表于Pesticide Biochemistry and Physiology的题为“Interacting effect of diclofop-methyl on the rice rhizosphere microbiome and denitrification”的研究，该研究采用GC-MS非靶向代谢组学和16S rRNA测序研究水稻培养物中残留的DM浓度可能通过影响水稻根际微生物群落而影响氮素循环，该研究对农药与水稻微生物群与氮循环之间复杂的生物地球化学相互作用提供了新的见解。

中文标题：甲基双氯酚对水稻根际微生物群及反硝化作用的影响

研究对象：水稻根际土壤微生物

发表期刊：Pesticide Biochemistry and Physiology

合作单位：浙江工业大学

运用欧易/鹿明生物技术：GC-MS代谢组学（由鹿明生物提供技术支持）、16S rRNA测序

研究背景

根际微生物群是植物高度进化的外部功能环境。根微生物群在植物生长、发育（例如开花时间）和抗病性中起着关键作用。根际植物微生物群的相互作用也驱动了氮的全球生物地球化学循环，它们影响生物氮的利用，以及氮的流失和厌氧氨氧化。土壤中残留的DM可以影响多种代谢途径，增加水稻中的有机酸分泌。由于植物分泌物（如糖、有机酸和氨基酸）是根际微生物组分的主要驱动因素，DM对水稻根系分泌物的影响增加了一种可能性，即复杂的植物-微生物群相互作用可以调节水稻中DM的毒性，以及影响养分生物地球化学循环和植物生长的特异微生物的丰度。

为了更好地了解土壤氮素循环与水稻体内残留DM的相互作用，本文研究了DM暴露对水稻根系分泌物、根际微生物群和潜在氮素损失的影响。采用16S rRNA测序研究了DM对水稻根际和土壤微生物群落的影响。用GC-MS非靶向代谢组学分析了根系分泌物的组成和浓度，并用qRT-PCR（反硝化相关关键基因的转录）和15N同位素质谱法研究了DM暴露和土壤微生物群落对土壤潜在反硝化（和肥料损失）的影响。

研究思路

研究结果

1.暴露于DM的水稻幼苗的根系分泌物概况

通过GC-MS非靶向代谢组学鉴定了186种根系分泌物。在5dDM暴露后，28个根系分泌物的浓度与对照组相比有显著差异。28种根系分泌物包括7种氨基酸、5种脂肪酸、7种糖或糖醇，其余分散在各种类别（碳氢化合物、酰胺、邻苯二酚、邻苯二甲酸盐、碱基、羟基酸、羧酸、羟基酮和萜烯）中（图1A）。

在差异分泌的糖中，响应于5dDM暴露，erythrose增加了12.7倍，而leucrose减少了约5倍（图1A）。5dDM暴露影响涉及嘧啶代谢、泛酸和CoA生物合成，β-丙氨酸代谢，脂肪酸生物合成途径中代谢产物的分泌。在10d暴露后有28种不同分泌的根系分泌物（图1B）。10dDM处理后，7个和21个类别的根系分泌物分别增加和减少。这些受DM影响的根系分泌物参与丙酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、植物激素生物合成和酪氨酸代谢（图1B）。

图1 | 热图显示根分泌液浓度受100μg/ LDM暴露5d（A）或10d（B）的影响

OPLS-DA显示，在DM暴露5d或10d后，对照组和DM组的根系分泌物分布没有重叠（图2A和B）。PCA还显示，对照组和5d DM组的根系分泌物分布在统计上不同的组中。与OPLS-DA分析相反，基于PCA分析，10-d DM组和对照组重叠（图2C）。因此，多变量分析表明，暴露5d后，根系渗出的影响比暴露10d后更多。

图2 | 关于影响根系渗出的因素的多元分析

（A）在不存在（对照）或存在100μg/ LDM的情况下，生长5d后根系分泌物的分析；

（B）在不存在（对照）或存在100μg/ LDM的情况下生长10d后，根系分泌物的分析；

（C）与各自的对照相比，暴露于100μg/ LDM5和10d后根系分泌物的分析。

2.5dDM暴露对水稻根际和非根际微生物丰富度和多样性的影响

生长5d后，对照组和DM处理组根际微生物组分别鉴定出4557和5002个OTUs。用Chao1和ACE指数估算DM处理的物种丰富度分别为9026/9974（Chao1/ACE），高于对照（8240/8921）。5dDM处理组根际微生物群落Shannon多样性指数也高于对照组。

蛋白菌是根际的主要细菌门（图3A和B）。DM暴露5d后，蛋白菌比例由对照组的42.1%上升到55.4%（p<0.01）。相比之下，在暴露于DM的5d后，phyla、Firmicutes和Acidobacteria的相对丰度分别从对照组的22.0%和16.9%降至8.9%和13.9%（图3A和B）。Azospira，Clostridiales和Rhodocyclaceae属的相对丰度分别从对照组的7.1％，0.3％和1.1％增至总根际微生物的21.0％，2.4％和2.3％（图3C）。在所有根际属中，Clostridium，Azospirillum和Zoogloea减少最多，即在DM处理5d后分别从对照组的5.3％，7.5％和5.6％降至1.3％，5.0％和4.7％。在属级上，非根际土壤经5dDM处理后，仅Ellin6513和koribacteracea（均为酸杆菌门）的相对丰度增加，由对照的10.5%和7.0%增加到5d后的17.4%和8.6%，TM7-1属的相对丰度从对照组的5.6%下降到DM治疗组的3.4%（图3C）。

图3 | 暴露于100μg/ LDM5d或10d后，根际和非根际的细菌多样性。

（A）5d后对照中水稻根际的细菌类群；

（B）暴露于100μg/ LDM5d后，水稻根际中的细菌类群受到严重影响；

（C）在无（对照）或有100μg/ LDM生长5d后，通过水稻根际和非根际中16S rRNA基因的MiSeq-焦磷酸测序测得的所有细菌属的相对丰度；

（D）在不存在（对照）或存在100μg/ LDM的条件下生长10d后，通过水稻根际和非根际的16S rRNA基因的MiSeq-焦磷酸测序测定的所有细菌属的相对丰度。

3.10dDM暴露对水稻根际和非根际微生物丰富度和多样性的影响

经10d干物质暴露后，用Chao1和ACE指数估算的根际微生物群落中细菌丰富度分别为9418和10445（Chao1/ACE指数），均高于对照组（7783/8366）。DM处理组水稻根际微生物多样性指数高于对照组。Candidatus Koribacter、Azospirillum和Kroibacteriaceae相对丰度分别从对照组的2.4%、2.3%和3.8%显著增加到10dDM处理后的3.7%、5.4%和7.5%。Bdellovibrio 和Methylibium属的相对丰度分别从对照组的5.5%和1.1%下降到10dDM暴露后的3.2%和0.3%（图3D）。Ellin6513和Koribacteracea的相对丰度从对照组的14.9%和7.6%下降到10dDM处理组的9.4%和6.1%，而只有Cytophagaceae从对照组的0.3%上升到10dDM处理组的1.4%（图3D）。

4. DM对根际电位反硝化和固氮的影响

与对照组相比，5dDM处理后的潜在反硝化速率显著增加了1.3倍，即从对照组的374.8μmolN₂/kg·h增加到DM处理组的485.2μmolN₂/kg·h。脱氮相关基因（nosZ）的转录在DM处理5d后比对照组显著上调1.7倍，但nifH转录在5dDM暴露后没有显著上调或下调。

研究结论

此研究表明，DM增加了水稻根际微生物群的多样性和丰富度，但对非根际微生物的多样性和丰富度影响较小。土壤生物圈的变化可能是DM暴露后根系分泌物浓度增加的结果，而不是DM的直接影响。水稻培养物中残留的DM浓度可能通过影响水稻根际微生物群落而影响氮素循环。该研究对一种常用的农药对水稻微生物群与氮循环之间复杂的生物地球化学相互作用提供了新的见解。

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文章研究了除草剂甲基双氯酚（DM）对水稻根系微生物的影响及其与N循环的关系。为此，研究将水稻幼苗暴露于100μg/ L DM中，并使用MiSeq-焦磷酸测序，GC-MS非靶向代谢组学、16S rRNA测序测定根系分泌以及15N同位素示踪法和qRT-PCR研究了根际微生物区系。暴露于DM后，根际微生物的丰富性和多样性与氨基酸、糖和脂肪酸的根系分泌物显著增加。水稻根际反硝化相关基因转录和反硝化速率显著增加。结果表明，DM对水稻根际细菌营养物质的分泌有显著影响，影响根际微生物群落，并可能影响根际N循环。

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参考文献：

Qian, H.F., Zhu, Y.C., Chen, S., et al. Interacting effect of diclofop-methyl on the rice rhizosphere microbiome and denitrification[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2018, 146: 90-96.

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