外泌体蛋白质组|ALZHEIMERS DEMENT（IF 16.655）：蛋白质组学研究助力阿尔兹海默症生物标志物筛选

鹿明生物

2023.5.18

2023年4月Madhurima Chatterjee发表了题为“C1q is increased in cerebrospinal fluid-derived extracellular vesicles in Alzheimer''s disease: A multi-cohort proteomics and immuno-assay validation study”的研究成果，作者使用多队列蛋白质组学和免疫测定（Elisa）验证，发现在阿尔兹海默症（AD）患者的脑脊液（CSF）中C1q的表达显著增加，表明C1q蛋白的表达变化与阿尔兹海默症的发生有关。该研究结果为未来阿尔兹海默症的预防和治疗提供了潜在新方向。

中文标题：阿尔兹海默症脑脊液来源的细胞外囊泡中C1q增加：一项多队列蛋白质组学和免疫验证研究

研究对象：脑脊液细胞外囊泡

发表期刊：Alzheimer’s & Dementia

影响因子：16.655

发表时间：2023年4月6日

发表单位：德国神经退行性疾病中心

运用生物技术：DIA非标记定量蛋白质组、Label Free蛋白组、ELISA

01研究背景

细胞外囊泡（EV）是由所有中枢神经系统细胞释放的直径为50-200nm的囊泡，包括神经元细胞、星形胶质细胞，少突胶质细胞和小胶质细胞。EV在细胞间通讯和有毒细胞含量的释放中起着重要作用，从而调节关键的细胞过程，如信号传导、转移、血管生成或炎症。在许多神经退行性疾病中，包括帕金森（PD）、肌萎缩侧索硬化症和阿阿尔兹海默症（AD），EVs已被认为有助于疾病病理的扩散。

AD的特征是聚集的β-淀粉样蛋白（Aβ）在脑内的细胞外沉积，神经原纤维缠结中过度磷酸化的tau蛋白在细胞内聚集。许多神经退行性疾病的病理开始在大脑的特定区域发展，然后以特定模式缓慢扩散到其他区域。然而，这些聚集的蛋白质如何从大脑的一个区域传播到另一个区域仍然是个谜。最近，许多研究表明，Aβ和tau通过EV从一个细胞转移到另一个细胞是可能的机制之一。

本研究的主要目的是确定新的CSF EV相关的生物标志物。为了全面了解在AD中可能被改变的EV相关蛋白或途径，并对EV在神经退行性疾病中的作用提供新的见解，有必要确定神经退行性疾病中CSF EV蛋白谱。此外，EV蛋白可以作为诊断和预测的生物标志物，有助于临床试验的患者分层。

02研究思路

03研究结果

1. 脑脊液EVs蛋白质组学分析

采用数据非依赖性（DIA）模式对队列1（AD=22，对照=15，哥廷根）脑脊液EVs进行蛋白测，总共检测到613种蛋白质，其中50种已在ExoCarta（在线数据库平台，可对与蛋白质，RNA和脂质有关的外泌体特定数据进行编目）前100种蛋白质（exocarta.org）中鉴定出来（图1 A），包括CD9、CD63和PDCD6IP（ALIX）等EV标志物。由于ExoCarta是EV相关蛋白的最大数据库之一，因此作者通过分析ExoCarta与超速离心法和Vn96两种方法分离的EVs的蛋白质组重叠来检测EVs的质量。

在队列2（AD=20，对照=16，阿姆斯特丹）中，使用合成的Vn 96肽从CSF中亲和捕获EV，进行数据依赖性采集（DDA）质谱法对蛋白检测，共鉴定了468种蛋白质，其中274种蛋白质与队列1重叠，21种蛋白质与ExoCarta前100种蛋白质重叠（图1 B）。

对队列1和2检测到的蛋白进行富集分析，发现都富集到诸如细胞外囊泡、膜结合囊泡等条目（图1 A）。这表明这两种方法都可以有效地从脑脊液中分离EV，但是在蛋白质组成和鉴定蛋白质数量方面存在细微差异。由于亲和纯化可能仅代表脑脊液中存在的EV总群体的一部分，因此作者决定使用超速离心纯化的EV执行所有验证步骤。

图1 | 队列1和队列2蛋白组学分析

通过Pearson相关性和主成分分析（PCA）对队列1的蛋白质丰度数据进行分析，发现AD患者和对照组的蛋白质组谱存在显著差异（图2）。在AD患者的CSF EV样品中，有114个蛋白质与对照组相比有明显的改变，其中26个蛋白质明显增加，88个蛋白质明显减少。值得注意的是，与非痴呆对照组相比，AD患者的CSF EV相关的补体蛋白C1q、C1r和C1s都有所增加（图2 A）。上调蛋白GO分析显著富集到补体激活的调节、免疫效应过程的调节和体液反应的调节（图3 A）。下调蛋白与中性粒细胞脱颗粒和中性粒细胞激活有关（图3 B）。

图2 | 队列1脑脊液蛋白分析

图3 | 队列1蛋白组学富集分析

2. 使用 ELISA 验证 C1q 和其他生物标志物

接下来，作者使用ELISA验证了补体因子C1q在AD中相对于对照组上调。此外，在AD动物模型中，C1q对突触的调理作用被证明有助于神经退行性变，而在人类AD大脑中，C1q高表达与淀粉样斑块相关。在队列3中（AD=24，对照=16，波恩），AD组CSF EV C1q水平显著高于对照组（P=0.03，图4 A）。

由于在队列3中发现C1q明显增加，所以在一个更大的队列，即队列4（AD=43，对照=100，阿姆斯特丹）中验证了这个生物标志物。在队列4中，与队列2相似，与对照组相比，AD组的CSF EV C1q水平明显升高（图4 C）。此外，作者还验证了AD CSF EVs中的下调蛋白醛缩酶C（ALDOC）)和组织蛋白酶B（CTSB），结果与组学结果一致。