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在线样品处理加快兽药残留分析

2020.3.09

为了保证食物供应链的安全性和全球健康风险管理的有效性，对食品和农产品中化学物质残留水平进行精确的检测是非常必要的。而化学物质的残留分析要求检测技术具有足够高的灵敏度，能够在污染物的最大检出限（MRL）或最大检出限水平以下从给定样品中检出被污染物并对其进行定量。另外，因为食品安全相关规定日益严格，所要检测的样品数量也在不断增大，因此分析技术是否具备高通量处理样品的能力也是非常关键的。

孔雀石绿（MG）是一种三苯甲烷类人工合成有机化合物，既是染料，也是高效杀菌剂，而且价格低廉。因此它在水产养殖过程中被广泛使用，特别是在亚洲地区。

孔雀石绿（MG）在代谢过程中降解成无色孔雀石绿（LMG），研究发现：无色孔雀石绿在含脂肪的鱼的器官中会发生累积现象，因为人们在已经检测不到孔雀石绿的样品中仍然会发现无色孔雀石绿的残留。而研究证明，无论是孔雀石绿还是无色孔雀石绿，都有潜在的致癌活性。因此，在许多国家，包括美国、加拿大和欧盟，孔雀石绿已经被禁止作为兽用药在水产养殖业使用。鱼肉中有关孔雀石绿和无色孔雀石绿的残留总量的最低允许限量（MRPL）为2μg/kg（ppb）。

图1. 孔雀石绿、无色孔雀石绿的化学结构式。

图2. 环丙沙星的化学结构式。

环丙沙星是一种广谱性抗菌素（化学结构式见图 2），属于氟喹诺酮家族的成员之一。氟喹诺酮类是近年来人工合成的一系列新型杀菌性抗菌药物，因其抗菌谱广、抗菌活性强等特点而广泛应用于畜禽饲养业和水产养殖业的多种感染性疾病的防治当中。然而，食品中氟喹诺酮类残留会诱导人类致病菌产生耐药性。因此，随着氟喹诺酮类药物在动物源性食品中的广泛应用，其残留问题越来越引起社会各界的广泛关注和有关部门的高度重视。FDA禁止动物食品中氟喹啉的超标使用。欧盟法规规定氟喹诺酮类药物恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星的总量在所有生产食品的动物肌肉和猪肝脏中的最大残留限（MRLs）分别为100μg/kg（ppb）和200μg/kg（ppb）。

四环素是一种聚酮类抗生素，它对一些革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有高效作用（化学结构式见图3）。和其他兽用抗生素一样，四环素用于食用动物后，在动物体内和畜禽产品中会有残留现象，残留的四环素同样会使得人们对这些药物的耐药性提高。欧盟兽药残留也对此作了相关规定，四环素在所有生产食品的动物肌肉和猪肝脏中最大残留限（MRLs）分别为100μg/kg（ppb）和300μg/kg（ppb）。

图3. 四环素的化学结构式。

Thermo Fisher Scientific 针对以上残留检测需求提出了相应的解决方案——Aria TLX系统，该系统将Turbo Flow 技术与TSQ Quantum Access质谱技术完美结合在一起。它为LC-MS/MS质谱配置了在线样品提取功能，与传统的脱机提取方法相比，该方法进行食品中化学物质残留分析更快捷，更可靠。Turbo Flow 技术通过扩散溶解、尺寸排阻、柱层析技术将蛋白等一些大分子物质滤掉，将小分子保留。工作人员可以直接注射检测样品进入LC-MS系统进行分析，大大简化了样品制备过程，并提高了检测通量。

实验过程

1．样品制备

乙腈提取法：虾（具头）、罗非鱼和猪肝脏分别各称取3~4g，与30ml乙腈充分混匀，室温放置10min，上层液体被移入到0.22μm的微孔离心管中，10?000rpm离心10min，转移上清到50ml玻璃闪烁瓶中，即为制备的样品。该样品制备过程总共需要25min。

图4. 猪肝脏中500 ng/kg （ppt）四环素的检测。

标准溶液配制：1mg/L的孔雀石绿、无色孔雀石绿、环丙沙星、四环素混合溶液为储存溶液，用甲醇将之稀释到0.1mg/ml（1000μg/ml）。标准溶液是通过梯度稀释的方法将储存溶液稀释到合适浓度并加入到3个已制备样品中，其浓度范围为10μg/kg～5ng/kg。

以上总的样品制备过程大致需要30~40min。

2.Turbo Flow方法

Aria TLX-1系统（Thermo Fisher Scientific，Franklin，MA）：多柱模块（MCM）允许6根上样柱和6根分析柱一次性检测，使得方法开发更为容易。首先，上样柱能使得每一种分析物都达到高的回收率。由于所有的被分析物都溶解在一种储存溶液中，运行所需时间就被最大程度地缩短了。所选择的分析柱也具有高分离性能。Aria TLX Turbo Flow方法所需的运行时间少于6min。

图5. 两种方法所得的标准曲线。

3.MS条件

TSQ Quantum Access三重四极杆质谱仪（Thermo Fisher Scientific，San Jose，CA） MS条件如表2所示。

结果讨论

在该研究中，多种食物基质中的环丙沙星、四环素、孔雀石绿、无色孔雀石绿都可以同时被检出。

LC-MS/MS 在进行化学物质的残留分析之前，需要进行大量样品预处理，而此过程是费时费力的。带有Turbo Flow技术的Aria TLX系统可以消除冗长的样品预处理步骤。该研究中每个样品只需要进行一次离心去除颗粒状杂质即可直接进样，省去了样品预处理中大多数费时的步骤，它不仅提高了样品处理的通量，还减小了由于操作步骤中的错误和可变因素而带来的误差。

Aria TLX系统的分析软件在一个单独的系统中HPLC和Turbo Flow方法都可运行，所需要的操作仅仅只是注射样品，其余的事情都由分析软件完成。为了评价一个标准的HPLC和Turbo Flow方法在性能上的差异，本研究中提取的每一个样品都分别用两种方法进行了分析。两者的不同在于：标准的HPLC 方法中，样品仅通过分析柱。Turbo Flow方法中，样品既通过Turbo Flow上样柱又通过分析柱。图4给出了两种方法分析被500 ng/kg（ppt）四环素污染的猪肝脏的检测结果。从图上可以看出：Turbo Flow法检测谱图中已经没有了在标准的HPLC检测谱图中出现的干扰峰。而且Turbo Flow技术中涡流的特点也成功地去除了导致离子抑制的基质干扰。

通过峰面积法对猪肝脏中的环丙沙星进行定量，分别得到两种方法所测结果的标准曲线（见图5）。同时根据以上结果分别计算出两种方法的定量限（LOD）、相对标准偏差（RSD%）、R2等参数，详情请见表3。从表3中可以看出Turbo Flow法检测的结果有优异的R2值，在给定的浓度检测范围内，R2值都大于0.99。TLX系统检测结果相比标准的HPLC结果，各个方面都有明显改善。

通过对表3中鱼、虾和猪肝脏提取物中环丙沙星、孔雀石绿、无色孔雀石绿和四环素的检测结果的比较分析可以看出，LC-MS/MS配置的Turbo Flow在线提取法进行分析所得的定量限（LOQs）明显优于标准HPLC方法所获得的定量限（LOQs）。检测限的提高缘于在Aria TLX系统中内源性组织的污染消除和离子抑制效应的降低。

结论

Aria TLX-1系统与TSQ Quantum Access质谱联用进行食物样品中兽药残留的定量检测，灵敏度高、分析时间短、可靠性强。Turbo Flow方法允许样品直接进样，大大减少了样品预处理的步骤。相比传统离线进行样品预处理的方法来说，分析所需要的总时间大大缩短。另外，与标准的HPLC方法相比，Aria TLX-1系统有效降低了离子抑制和基质效应。

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周锦帆