二氢硫辛酰胺乙酰基转移酶实验——Stopped 实验
| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | |
| 实验步骤 | 实验所需「试剂」具体见「其他」 0.98 ml 实验混合物
0.02 ml 酶样品 30 ℃ 培养 15 min，加入 0.1 ml 1 mol/L HCl 停止，沸水浴 5 min。而后 0.4 ml 的测定用量溶于 0.2 ml 2 mol/L 羟胺，并且室温下持续 10 min 后加入0.6 ml FeCl3 试剂。离心 5 min后测量 546 nm 吸收值。
|
| 注意事项 | |
| 其他 | 试剂： 0.1 mol/L Tris-HCl，pH 7.6 0.01 mol/L CoA（游离酸，Mr＝767.5，CoA·Li3，Mr＝785.4；23 mg 溶于 3 ml 水中） 1 mol/L 乙酰磷酸（LiK 盐，Mr＝184.1；1.84 mg 溶于 10 ml 水中） 磷酸转乙酰酶（乙酰-CoA：正磷酸转乙酰酶，4000 U/ml） 0.2 mol/L DL-二氢硫辛酰胺 1 mol/L HCl 2 mol/L 羟胺（等量的 4 mol/L 羟胺，Mr＝69.49 和 4 mol/L KOH，Mr＝56.11混合） FeCl3 试剂 100 ml 5％ FeCl3（8.33 g FeCl3·6H2O，Mr＝270.3，用 0.1 mol/L HCl 补充至 100 ml） 100 ml 12％ TCA（三氯乙酸，Mr＝163.4） 100 ml 3mol/l HCl（1：3 的比例混合 HCl 和 H2O） 将三种溶液混合 展开 |
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