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新一代SPR 技术在钙调蛋白与NOS研究中的应用(一)

2020.5.11

EF手性对突变钙调蛋白与一氧化氮合酶结合域肽段相互作用研究

一氧化氮合酶(NOS)是一种非常重要的生物小分子NO合成催化酶,一氧化氮合(NOS)包括三个同型酶:神经酶(nNOS), 和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。每种酶产生的NO分别用于神经传递、血管舒张和免疫应答.一氧化氮合酶是通过钙调蛋白结构阈将N末端氧化酶结构域和c-末端结合域形成的同源二聚体蛋白。

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一氧化氮合酶(NOS)能催化L-精氨酸生成NO及在几个关键的生理过程中起主要作用,钙调蛋白(CaM)是小的泛素化Ca+2偶联蛋白,用于激活(NOS);钙调蛋白通过EF手性变化与Ca+2结合,但钙调蛋白激活NOS的机制还不完全清楚.目前用于CaM与NOS 相互作用研究方法较为复杂、耗时。为此,加拿大waterloo大学的John通过niocya 公司最新开发的LSPR 实时无标记检测技术分析了不同手性对突变的CaM与NOS相互作用,对比CaM与NOS 的结合亲和力,对通过简单方法获得的 CaM-NOS作用结果进行了动力学数据不错,揭示CaM通过EF手性对突变激活NOS! 并将该成果与研究方法在2017化学生物物理学研讨会进行了分享。

CaM是一种小的,高度动态的,催化Ca2+结合的蛋白,几乎存在所有真核生物体中,对NOS的活性是必须的。它由一个可变的中心连接子区连接的球状N末端和c-末端结构域构成,每个区域CaM 通过2对手性基序与Ca2+结合,可以结合4个Ca2+,这些基序对于相互结合及NOS的活性是必须 。

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图为:钙调素的Ca2+不同结合状态(A)Apo-CaM  (B) HOLO-CaM   (C) HOLO-CaM结构紧凑

 

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图为:不同的CaM EF手性突变后结构示意图。

根据之前实验获取的一些信息,John团队利用Nicoya 的LSPR ZL技术产品OpenSPR实时无标记技

术对CaM与NOS的激活机制做检测;实验过程先对经电泳验证过表达的CaM纯化并做了质量鉴定,之后用于与NOS相互作用研究。

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图:CaM纯化后SDS-PAGE 分析结果


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