DNA印迹法实验步骤转移的相关介绍
1)取一个较大的方形瓷盘,放一块玻璃板于盘上,盘内加转移液(6×SSC或10×SSC)使液面距离玻璃底面约1,2cm,玻璃板表面盖两张预先用转移液浸润的Whatman 3M ·滤纸(也可用新华滤纸),滤纸两端浸入SSC转移液中,用一玻璃棒将滤纸压平,滤纸与玻璃板间不得有气泡,
2)将琼脂糖凝胶翻转(样品孔朝下)后置于上述铺有Whatman 3M·滤纸的平台上,注意:两者之间不能有气泡。
3)用parafilm 蜡膜将凝胶四周平台上裸露的滤纸封严,防止在转移过程中因短路(转移液直接从盘中流向吸水纸而不经过凝胶)使转移效率降低,甚至转移失败 ,
4)将处理好的NCP(已切去一角)小心地覆盖在凝胶上(滤膜的光泽面即标有N.C字样的一面朝向凝胶),NCP的一端与凝胶的上样孔对齐,切去的一角与凝胶切角的位置对齐。 注意,滤膜与凝胶之间不能有气泡,且NCP一旦与凝胶接触即不可再移动,因为从接触的一刻起,DNA已开始转移,
5)将预先用转移液浸润过的与NCP大小相同的Whatman 3M滤纸覆盖在硝酸纤维素膜上,排出滤纸与膜之间的气泡,
6)再放几张相同大小的干滤纸和一叠厚约10,15cm的吸水纸于滤纸上,顶部压一块玻璃板和1kg左右的重物。
7)静置12,15小时使其充分转移,其间换吸水纸1,2次。转移液在吸水纸的虹吸作用下从盘中转移到吸水纸上,从而带动DNA从琼脂糖凝胶中转移到NCP上,
8)转移结束,移去吸水纸和滤纸,在NCP上用铅笔标上点样孔的位置。·将NCP浸泡在2×SSC中5分钟以去除琼脂糖碎块。将膜放置于一张干燥的新鲜滤纸上,
9)在紫外灯下观察凝胶和NCP膜,以了解DNA转移的情况。·在紫外灯下凝胶不显示荧光,NCP膜呈桔红色,并可见到条状的DNA带。
10)把NCP置于两层干燥新鲜的滤纸间,真空下80℃烘烤2小时(亦可用其它方法)。此过程可使DNA更加牢固地固定于NCP上。
11)此NCP既可直接用于杂交,亦可用塑料薄膜密封,置,20℃冰箱保存备用。
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焦点事件
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综述
