质粒DNA提取技术
实验概要
通过本实验，学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法和技术。
实验原理
质粒是基因工程中常用的载体之一。质粒是染色体外小型双链环状的DNA，大小在1～200kb之间。
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们的。
在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会断裂，但两条互补链彼此缠绕，仍会紧密的结合在一起。当加入 pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液，恢复pH至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
主要试剂
1. 溶液Ⅰ
2. 溶液Ⅱ
3. 溶液Ⅲ
4. 70%乙醇
5. 胰RNA酶(10mg/mL)
6. 平衡酚
主要设备
1. 恒温培养箱
2. 恒温摇床
3. 台式离心机
4. 高压灭菌锅
5. 移液枪
实验材料
1. 葡萄糖
2. 三羟甲基氨基甲烷（Tris）
3. 乙二胺四乙酸（EDTA）
4. 氢氧化钠
5. 十二烷基硫酸钠（SDS）
6. 乙酸钾
7. 冰乙酸
8. 氯仿
9. 无水乙醇
10. 胰RNA酶(10mg/mL)
11. 氨苄青霉素（100mg/mL Amp）
12. 平衡酚（pH8.0）
13. 盐酸（HCl）
14. 含pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌
15. 吸嘴（枪头）
16. 小指管（离心管）
实验步骤
1. 将25mL含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基加入100mL锥形瓶中，接入含R-pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2. 收菌，吸取1.5mL培养物加入1.5mL离心管中，4000r/min室温离心2min。
3. 吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
4. 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混匀，室温放置10min。
5. 加入200μL溶液Ⅱ(新鲜配制)，盖紧盖子，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6. 加入150μL溶液Ⅲ(冰上预冷)，盖紧盖子，颠倒数次使混匀。冰上放置15min。
7. 12000r/min离心15min，将上清转至另一离心管中。
8. 向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min离心5min，将上清转至另一离心管中。
9. 向上清中加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
10. 12000r/min离心5min，倒去上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
11. 用1mL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡，12000r/min离心5min，倒去上清液，空气干燥。
12. 加20μL纯水(含20μg/mL胰RNA酶)，使质粒DNA完全溶解，－20℃保存。
（注：1mL纯水中加2μL10mg/mL的胰RNA酶配制成溶解质粒的纯水。）
13. 在下次实验中观察实验结果，通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA。
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