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质粒DNA的抽提、沉淀及琼脂糖凝胶电泳

2020.9.08

一、实验目的
·学习酚、氯仿抽提去除蛋白质的基本方法

·了解质粒DNA的抽提方法

·学习掌握琼脂糖凝胶电泳的方法

·熟练取液枪的使用方法

二、实验原理

·在DNA的粗提液或其他的DNA反应体系中，一般都混有蛋白质、寡糖苷酸等杂质。酚和氯仿可以使蛋白质变性，离心后变性蛋白质存在于有机相和水相之间的界面，吸取上层含有DNA有水相，继续用氯仿抽提可以进一步使残留的蛋白质变性并去除水相中残留的酚。由此得到纯度较高的DNA水溶液，可以加盐和乙醇最后经高速离心得到DNA沉淀。

·琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的常用方法。琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物。琼脂糖凝胶电泳通常利用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。电泳结束后，直接用低浓度的溴化乙锭染色，在紫外灯下可以确定DNA的位置。

·质粒（plasmid）通常指细菌中独立于染色体外，能自主复制的遗传因子，它能够稳定地遗传某些性状。天然的质粒都是环状双链DNA，大小从 5kb到400kb不等。质粒虽然独立于染色体外自主复制和遗传，但其复制又依赖于宿主编码的酶和蛋白质复制因子。质粒按照其稳定拷贝数的多少可分为严谨型和松弛型，严谨型质粒在每个细菌细胞中有1～5拷贝，松弛型质粒在每个细菌细胞中可达10～200个，甚至更多拷贝。

·质粒的结构：

1. 抗性基因(Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Ka-namycine resistance gene)

2. 启始复制子(ori, Origin of replication)；

3.多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)；

·细菌裂解的方法：

碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS

煮沸裂解法:沸水煮沸40秒

SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。

·SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒 DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。
三、实验器材与试剂

·溶液1- 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mMTris-HCl pH8.0。

溶液2－0.2mol/L-NaOH, 1%SDS

溶液3－乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)：60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸，

28.5mL H2O

·饱和酚(pH8.0 Tris-HCl饱和)、氯仿、3M乙酸钠溶液(pH5.2)

·TE缓冲液:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA ， pH8.0,

·100%乙醇与70％乙醇

·器材：取液枪、离心机、低压电泳仪、水平电泳槽、紫外透射仪

四、实验步骤

·质粒小量提取的方法：

1.培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小时;

2.取液体培养液1.5ml X 2于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100ml溶液I，充分混匀;置冰上;

3.加入200ml新配制的0.2mol/L NaOH+1％SDS（溶液II ），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置2--3min;

4.加入150 m l乙酸钾溶液(溶液III)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min;

5.用台式高速离心机，12000r/min离心10min，上清移入另一干净离心管，并加3ul RNaseA, 37C保温30min;

6.上清中加入等体积的酚/氯仿抽提一次,等体积氯仿抽提一次;每次均要振荡—离心(10000rpm离心1min) —吸取上清到新的离心管中;

　注：吸取酚时，要枪头伸入两液面交接处下方，因为上层为水。

7.上清中加入1/10 体积3M乙酸钠溶液(pH5.2) ,和2.2倍体积的无水乙醇,混匀后-20℃保存15min 。

8. 12000rpm 离心15分钟，弃去上清，沉淀加入1ml 75％乙醇洗涤， 12000rpm 离心2分钟，彻底弃去上清，真空干燥或烘干。

9.沉淀溶解于30ul TE溶液，取10ul 电泳检查

10．电泳结束后（溴酚蓝走到胶的正中位置附近），将凝胶拿到成像系统中拍照。

·琼脂糖凝胶电泳

电泳体系：1％琼脂糖凝胶，

电泳缓冲液：1 × TAE （由50 × TAE稀释）

电泳方式：稳压，<5/cm

100ml 1％琼脂糖凝胶配制方法：100 ml 1 × TAE溶液中加入1克琼脂糖

染料：GoldView DNA染料

染料用量：5ul/100ml凝胶

显色：紫外灯下，双链DNA呈绿色；单链DNA呈红色

质粒dna

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周锦帆