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用于基因组文库的真核DNA的部分酶切（制备反应）实验

2019.9.10

实验方法原理	通过限制酶部分酶切可将高分子质量 DNA 片段化。在预实验中，建立了适宜的部分酶切条件。对于将用于克隆的基因组 DNA 来说，预实验的结果确定了对其进行制备的三个大规模反应的条件，这将在本方案叙述。
实验材料	限制性内切核酸酶基因组 DNA λ 噬菌体 DNA 质粒寡聚体
试剂、试剂盒	乙酸铵乙醇正丁醇酚：氯仿乙酸钠蔗糖凝胶上样缓冲液 TE Tris-Cl
仪器、耗材	琼脂糖凝胶 Beckman SW28 或相当型号透析袋梯度分级分离设备蔗糖梯度
实验步骤	一、材料 1. 缓冲液和溶液乙酸铵（10 mol/L）乙醇正丁醇酚：氯仿（1:1, V/V）乙酸钠（3 moI/L, pH 5.2) 蔗糖凝胶上样缓冲液 TE ( pH 8.0) Tris-Cl (10 mmol/L, pH 8.0) 2. 酶和缓冲液限制性内切核酸酶 3. 凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶（0.6%），用 0.5X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭琼脂糖凝胶，用于脉冲场凝胶电泳 4. 核酸和寡核苷酸基因组 DNA, 高分子质量 λ 噬菌体 DNA 和质粒寡聚体 5. 离心机和转子 Beckman SW28 或相当型号 6. 专用设备透析袋，煮过梯度分级分离设备（gradient fractionating device）（可供选择）蔗糖梯度（用含 1 mol/L NaCl、20 mol/LTris-Cl（pH 8.0）、5 mol/L EDTA（pH 8.0）的缓冲液制备两种蔗糖溶液，一种含 10%（m/V）的蔗糖，另一种含 40%（m/V）的蔗糖。经 0.22 μm 硝酸纤维素膜的过滤进行无菌处理。）预置于 68℃ 的水浴二、方法梯度的制备 1. 在清亮的超速离心管中制备一个或多个 38 ml (10%~40%, m/V）蔗糖梯度，于 4℃ 静止 1~2 h 直到被使用（步骤 5)。 2. 建立一系列消化反应，每个含有 100 μg 的高分子质量 DNA。 (1) 用限制酶的三种不同浓度，而这三种浓度刚好跨过预实验中所确定的最佳浓度。 (2) 将各反应温育适当的时间。 (3) 用凝胶电泳分析部分酶切 DNA, 确证整个消化反应按预期的进行。得到结果后，将剩余样品置于 0℃。 3. 用酚: 氯仿轻轻地抽提消化 DNA 两次。 4. 通过标准的乙醇沉淀回收 DNA, 并溶于 200 μl TE ( pH 8.0) 中。通过梯度按分子质量大小分级分离 DNA 5. 将 DNA 样品于 68℃ 加热 10 min, 再冷却至 20℃，然后轻轻地加至梯度的顶层。将梯度于 20℃、83000 g ( 25000 r/min 于 Beckman SW28 转子中）离心 22 h。离心在室温进行而不是 4℃，是为了抑制分子内和分子间黏性末端的复性。 6. 用 21 号注射针头或梯度分级分离设备刺穿离心管底，收集 350 μl 样品。 7. 从收集的样品中每隔一管取 10 μl，与 10 μl 水和 5 μl 蔗糖凝胶上样缓冲液混匀。 0.6% 琼脂糖凝胶电泳分析所有样品中 DNA 的大小，并用质粒 DNA 寡聚体或其他高分子质量标准 DNA 作标志物。标志物中的蔗糖和盐浓度应与样品中的一致。 8. 电泳后，将含有理想大小 DNA 片段（如用于黏粒文库构建的为 35~45 kb, 用于 λ 噬菌体载体文库构建的为 20~25 kb) 的样品合并。 9. 将合并的样品置 2 L TE ( pH 8.0) 中，于 4℃ 透析 12~16 h, 4~6 h 后更换一次缓冲液。在透析袋中留出足够空间，因透析过程中样品的体积将增加 2~3 倍。另外，如果合并样品的体积足够小，可不必进行预透析，而用 TE ( pH 8.0) 进行稀释使样品中蔗糖浓度降低到 10% 或更低，然后直接用乙醇进行 DNA 沉淀。 10. 用等体积的正丁醇抽提透析样品数次，使样品体积降低至 1 ml 左右。 11. 在 2 mol/L 乙酸铵（来源于 10 mol/L 的母液）存在的情况下，于室温用乙醇沉淀 DNA。 12. 离心、回收 DNA, 并溶解于 TE ( pH 8.0) 中，浓度为 300~500 μg/ml。取一份 DNA ( 0.5 μg) 进行分析，用常规的 0.6% 琼脂糖凝胶电泳或脉冲场电泳确证消化产物的大小分布是正确的。将 DNA 保存于 4℃。 13. 为了建立基因组 DNA 文库，将分级分离 DNA 与 λ 噬菌体载体臂相连。展开