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灵敏度酶试剂快速测定农药残留量

2019.9.11

　　1 前言
　　有机磷和氨基甲酸酯类农药是果蔬种植中最常用的杀虫剂。此类农药的毒理机制为抑制人和动物体内胆碱酯酶的生理活性，使神经传导受阻，致使人和动物神经麻痹乃至死亡。
　　除了使用农药残留速测仪外采用酶抑制率法检测农药残留是目前我国控制农残超标的果蔬流入市场的最常用的快速检测方法。在这个技术中，酶试剂的性能是技术关键。从不同酶源中提取的胆碱酯酶，对不同的农药的敏感度是不同的。据文献报道，虽然胆碱酯酶试剂对多数有机磷和氨基甲酸酯类农药的灵敏度可在0. 01~10Lg/ml左右[1~3],但对国家明令禁止在果蔬上使用的高毒农药如甲胺磷、氧乐果等农药其残留却要达到几个甚至几十Lg/ml才能检出，而在我国由于高毒农药甲胺磷，氧乐果等价格低杀虫效果好而被果农菜农所滥用情况仍严重存在，如果胆碱酯酶试剂对这些农药的检测灵敏度低，则无法有效控制甲胺磷、氧乐果等高毒农药超标的果蔬流入市场。
　　本文介绍我们研制的胆碱酯酶试剂对甲胺磷、氧乐果的检测灵敏度达到[0. 3Lg/ml的水平，同时对其它常见的农药的检测灵敏度也达到[0. 5Lg/ml。
　　2 实验部分：
　　2. 1 酶源的筛选：
　　各种动物的肝、血清、脑部、肌肉中都含有丰富的胆碱酯酶，许多植物中的酶也可用于酶抑制率法检测农药残留。目前各种蜂的头部、果蝇头部、敏感家蝇头、猪肝、牛肝、鼠肝、兔血清、黄鳝血、马血清、鸭血清等作为酶源均有应用[4]。我们选择了六十余种动物酶源和淀粉类植物酶源，以甲胺磷、氧乐果作为目标进行比较筛选。
　　2. 1. 1 胆碱酯酶粗提液的制备：
　　a.动物肝脏：弃去筋，膜和脂肪，切碎后用1份肝脏和3份冰蒸馏水制成匀浆，浆液用细纱布过滤得到滤液，滤液于离心机上以4000转/分离心50分钟，上清液置于冰箱中备用。
　　b.动物的血清：将刚抽出的动物血液注入无抗凝剂容器中，在室温下使血液凝固后，置于冰箱中充分冷冻，然后离心分离凝块取上清液储藏于冰箱中备用。
　　c.昆虫类酯酶：昆虫分别加入0）4e缓冲液，正丁醇及适量的牛磺酸后，放入匀浆器中匀浆60分钟。浆液用细纱布过滤得滤液。于离心机上离心50分钟（4000转/分）。离心得到的上清液置于冰箱中备用。
　　d.动物的肌肉；弃去筋，膜和脂肪，切碎后用1份肌肉和5份0）4oC的缓冲液制成匀浆，浆液用细纱布过滤得到滤液，滤液于离心机上以4000转/分离心50分钟，上清液置于冰箱中备用。
　　e.植物淀粉：取适量的新鲜食用面粉，加入250ml的蒸馏水，振荡30分钟后，静置30分钟以上，取上清液经4000转/分离心50分钟后，收集上清液为酶粗提液，置于冰箱中备用。
　　2. 1. 2 对甲胺磷、氧乐果敏感度的考察方法：
　　用DTNB法（硫代乙酰胆碱-联硫代双硝基苯甲酸法）测定酶粗提液的活性，并将所制的各种酶粗提液的活性调整到基本一致后，采用酶抑制率法考察不同浓度的甲胺磷、氧乐果对各种酶源粗提液的抑制效果。
　　2. 1. 3 酶源筛选的测试结果比较：
　　表1 不同酶源的酶粗提液对甲胺磷农药的敏感度：

表1 不同酶源的酶粗提液对甲胺磷农药的敏感度：

　　表2 不同酶源的酶粗提液对氧乐果农药的敏感度：

　　由表1和表2实验数据可知当甲胺磷和氧乐果农药的浓度达到1. 26）5. 1Lg/ml时，敏感家蝇、马血清、小牛血清和平腹小蜂的胆碱酯酶粗提液才反映出一定的敏感度，而且需要的抑制时间较长。而酶源（II）的酶粗提液对甲胺磷和氧乐果的敏感度较好，在较短时间内对0. 5Lg/ml的甲胺磷和氧乐果就可以达到57%和45%的抑制水平。
　　2. 2 酶粗提液的提纯、活化由于酶粗提液中不但含有大量的脂肪、杂蛋白等干扰物质，而且还有其它的酯酶存在，其中有些酯酶如脂族酯酶就可以作为胆碱酯酶抑制剂的替代靶标，它们的存在大大影响胆碱酯酶对农药残留的检测，也降低检测的灵敏度。我们对酶粗提液进行了提纯活化处理，优化其对不同农药的选择性和敏感度，从整体上提高对有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测灵敏度。
　　2. 2. 1 酶粗提液的提纯方法：
　　采用硫酸胺分级沉淀法，确定并收集有效活性成分，将收集的沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，并在预先用磷酸盐缓冲液平衡过的层析柱上洗脱，收集有效的酶活性成分。
　　2. 2. 2 胆碱酯酶活化处理：
　　往经过层析柱洗脱收集到的有效活性成分中加入酶活化剂，搅拌令其充分反应后置冰箱中放置一定的时间再加入保护剂即得胆碱酯酶试剂。
　　2. 3 胆碱酯酶试剂对有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测性能：
　　2. 3. 1 不同酶源制的胆碱酯酶试剂对甲胺磷、氧乐果农药的检测灵敏度：
　　经过上述处理后的各种胆碱酯酶试剂对甲胺磷、氧乐果的检测灵敏度均有了提高，此时由酶源（Ⅱ）制备的胆碱酯酶仅10分钟的抑制时间对甲胺磷、氧乐果的检测灵敏度即可达到≦0. 3Lg/ml（以酶抑制率50%计）。
　　表3 不同酶源的胆碱酯酶试剂对甲胺磷农药的检测灵敏度：

表3 不同酶源的胆碱酯酶试剂对甲胺磷农药的检测灵敏度：

　　表4 不同酶源制备的胆碱酯酶试剂对氧乐果农药的灵敏度：
　　2.3. 2 酶源（Ⅱ）制备的绿T酶（Ⅱ）试剂对常用农药的检测灵敏度：
　　由表3表4可知，我们研发的绿T酶（Ⅱ）试剂仅需要10分钟的酶抑制时间即可对甲胺磷，氧乐果达到≦0. 3Lg/ml的检测灵敏度。在解决了甲胺磷，氧乐果检测灵敏度的基础上，我们还对多种常用的有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测灵敏度进行优化，使之对目前特别关注的难以解决的高毒农药如甲胺磷、氧乐果、毒死蜱、二嗪农等都能达到灵敏度[0. 3Lg/ml的检测水平。绿T胆碱酯酶（Ⅱ）试剂不仅大大提高了甲胺磷，氧乐果的检测灵敏度同时对大部分的有机磷和氨基甲酸酯类的农药的检测灵敏度均可达到[0. 5Lg/ml。见表5。
　　表5 绿T酶（Ⅱ）试剂对常用的有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测灵敏度

表5 绿T酶（Ⅱ）试剂对常用的有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测灵敏度

　　2. 3. 3 绿T酶（Ⅱ）试剂对几种常用农药的检测曲线：
　　按GB/T5009. 199）2003操作方法用不同浓度的农药标准溶液与绿T酶（Ⅱ）试剂作用，测定抑制10分钟的酶抑制率并制作出农药浓度~酶抑制率的关系曲线。见图1:
　　图1绿T酶（Ⅱ）制剂对几种常见农药的检测曲线

图1绿T酶（Ⅱ）制剂对几种常见农药的检测曲线

　　由以上几种农药浓度与酶抑制率的关系曲线可以看出，作用于胆碱酯酶试剂的农药的浓度越高，其受抑制的情况愈严重，则酶抑制率就愈高。
　　3 绿T酶（Ⅱ）试剂应用于果蔬中农药残留的快速检测：
　　目前胆碱酯酶（Ⅱ）已广泛应用于果蔬中农药残留的快速检测，我们用胆碱酯酶（Ⅱ）对福州市场上的72批38种果蔬样品进行快速检测同时用气相色谱仪测定农药残留量进行比对。两种方法的符合率为94%。
　　4 结论：
　　我们所研发的绿T酶（Ⅱ）试剂对高毒农药甲胺磷，氧乐果有较高的检测灵敏度（[0. 3），对大部分的有机磷和氨基甲酸酯类农药均有较好的灵敏度，对常用农药甲胺磷、氧化乐果、西维因、毒死蜱、久效磷、辛硫磷、呋喃丹、敌敌畏、敌百虫、对硫磷、二嗪农、甲基对硫磷等均达到<0. 5Lg/ml的检测水平；同时在实际应用中其检测结果与气相色谱有很好的符合性，是农药残留快速检测中具有较高灵敏度的酶试剂。

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周锦帆