文库甘油储存料中噬菌体抗体的制备
实验概要
本实验从文库甘油储存料中制备了噬菌体抗体。
主要试剂
1. 2×TY/amp/glu培养基
2. TYE/amp/glu平板
3. 含有25ug/ml卡那霉素和2％葡萄糖的TYE平板(TYE/kan/glu)
4. 含100ug/ml氨苄青霉素和25ug/ml卡那霉素的2×TY培养基(2×TY/amp/kan)
5. 辅助噬菌体(VCSMl3、R408或M13K 07 Stratagene、NEB或Amersham Biosciences)
6. 20％聚乙二醇(PEG)6000，2.5mol/L NaCl溶液
7. 磷酸盐缓冲液(PBS)，pH 7.4
主要设备
1. 500ml无菌聚丙烯离心瓶
2. 2L培养锥形瓶
3. RC5离心机和GS3转头(Sorvall)
实验材料
文库甘油储存料
实验步骤
1．取适当数量的甘油文库储存料接种到含有250m1 2×TY/amp/glu的 2L培养锥形瓶中。培养基的A600值应小于0.05。从每个培养瓶中取1ul铺板确定起始接种物的细菌量。
2．在37℃下振荡(300r/min)培养，直到A600值为0.05(1.5～2.5h)。
3．按照辅助噬菌体与细菌之比等于(10～20)：1的比例加入辅助噬菌体。孵育培养液，37℃30分钟，需水浴中直立放置并不时搅拌；而后，37℃振荡培养30分钟。
4．从每瓶中取lul并用1ml 2×TY稀释；取1ul及10ul分别在TYE/amp/glu和TYE/ kan/glu平板上铺板，以确定辅助噬菌体感染有效性。每个平板上的克隆数应当大致相同，同时卡那霉素抗性克隆数应大于氨苄青霉素抗性克隆数的10％。
5．将500ml瓶装入GS3转头，以3000r/min离心细菌培养液。弃去上清。
6．将细菌沉淀重悬于2×TY/amp/kan中，并分装到2L锥形瓶中；其中的培养液不应超过250ml。在25～30℃下振荡(300r/min)培养过夜。
7．用GS3转头及500ml瓶以10000r/min 30分钟离心菌液。将上清部分转移至1个新的500ml瓶内。
8．将l/10～1/5体积的PEG溶液加入到上清中，冰上放置1小时。这会使噬菌体沉淀，此时上清中会呈现云雾状。
9．用GS3转头及500m1瓶以4000r/min，4℃15分钟离心沉淀噬菌体。弃去上清。再离心“干”沉淀30秒，以甩掉最后几滴上清。去除液体。用1/10体积的PBS重悬沉淀。
10．以10000r/minl5分钟离心沉淀细菌碎片，并将上清转移至1个新瓶中。
11．重复步骤7-9以进一步纯化噬菌体，但最终重悬液的体积应当是起始培养液体积的1/50。这样制备的噬菌体可以立即用于选择，否则需按每份1013个噬菌体等量分装，保存于-80℃。
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