基因组DNA文库构建必备实验技巧-2
技术支持资料：
材料
缓冲液和溶液
- 碱裂解液I , 4°C
50 mM 葡萄糖
25 mM Tris-Cl (pH 8.0)
10 mM EDTA (pH 8.0)
配制碱裂解液I 约100ml，灭菌，保存在四度。
- 碱裂解液II，新鲜配置，室温保存
0.2 N NaOH （从10N的NaOH新鲜制备）
1% (w/v) SDS 碱裂解液II应该新鲜配制，室温保存。
- 碱裂解液III, 4°C
5M 醋酸钾，60ml
冰醋酸，11.5ml
SDW，28.5ml - 酒精
- 70%酒精 - 异丙醇 - 酚：氯仿（1：1， v/v）
- 醋酸钠 （3M,pH5.2）
- STE，4°C
10 mM Tris-Cl (pH 8.0)
0.1 M NaCl
1 mM EDTA (pH 8.0)
- TE (pH 8.0)
10 mM Tris-Cl (pH 8.0)
10 mM EDTA (pH 8.0)
载体与菌株 BAC转化的大肠杆菌
培养基和抗生素 含12.5μg/ml氯霉素的LB平板和液体培养基
酶和缓冲液
溶菌酶
RNaseA,不含DNase
限制性内切酶和相应缓冲液
核苷酸/寡核苷酸
用于脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis）的DNA
标准参照物
凝胶/点样缓冲液
脉冲场凝胶电泳（Pulsed-field gels，或者0.5%琼脂糖凝胶) 离心机/转头/离心管
其他 37摄氏度摇床
1.BAC DNA大量提取方案 （参考文献：Molecular cloning: A Laboratory Manual Third Edition）
此方案适合从500ml的菌液中提取BAC DNA，一般可以产生20-25μg纯化的DNA。
方法
1.将50μl BAC转化菌的过夜培养物接种到500ml含12.5μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，37℃ 震荡（280rpm）培养12到16小时。
2.2500g，4℃，离心15min，收集菌体。
3.用100ml冰预冷的STE重新悬浮细菌沉淀。按步骤2方法离心收集细菌。
4.用24ml含RNase（100μg/ml）的碱性裂解液I溶解细菌。加溶菌酶至终浓度为1mg/ml。
5.加入24ml新鲜配置的碱性裂解液II。盖紧离心瓶盖，轻轻翻转瓶子数次，使内容物完全混匀，冰裕5min。
6.加入24ml冰预冷的碱性裂解液III，盖紧瓶盖，轻轻翻转瓶子数次，使内容物完全混匀，置冰上5min。
7.15000g，4℃，离心10min，将上清转移到另一离心瓶中，弃沉淀。
8.加等体积的酚：氯仿。轻轻翻转离心瓶数次，混匀。3000g，室温离心15min。
9.将水相移至另一离心瓶中，加入等体积的异丙醇，翻转离心瓶数次，混匀。
10.15,000g，室温离心15分钟，回收核酸沉淀。
11.弃上清，用20ml 70%乙醇漂洗沉淀。
12.弃乙醇，风干使乙醇挥发殆尽。
13.小心将BAC DNA沉淀溶于0.2ml TE (pH8.0) 中。
2.BAC DNA的小量提取 （参考文献：Molecular cloning: A Laboratory Manual Third Edition）
此方案适合从5ml菌液中提取BAC DNA，一般可以产生0.1-0.4μg的BAC DNA。
方法： 1.挑取单菌落接种至5ml含12.5μg/ml氯霉素的LB培养基中，37℃剧烈震摇过夜。
2.2000g，4℃，离心5min，收集菌体。
3.在每个离心管中加5ml预冷的STE，用移液器吹悬细菌沉淀。按步骤2离心收集细菌。
4.将菌体重悬于200ul冰冷的碱性裂解液I中。将菌体转移至预冷的微量离心管中，置于冰上。
5.向管中加入400μl新鲜配置的碱性裂解液II。轻轻翻转数次，将离心管置于冰上。
6.向管中加入300μl冰冷的碱性裂解液III，轻轻翻转数次。将离心管置于冰上5min。
7.在微量离心机上以最大速度4℃离心5min，除去细胞碎片沉淀。将上清移入一新的微量离心管中。室温下加入900μl异丙醇，轻轻翻转数次离心管，混匀。
8.立即在微量离心机上室温下最大速离心5min，使核酸沉淀。弃去上清，用1ml 70%乙醇小心漂洗。室温下离心2min，吸去乙醇。室温干燥沉淀5-10min后，将沉淀溶于50μl TE（pH8.0）中.
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