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应用多重PCR方法鉴定RHD基因型的研究(2)

2019.8.03

　　2结果

　　2.1多重PCR方法的反应结果应用多重PCR方法可以鉴定不同的RHD基因型(图2)。根据扩增条带判断结果，D/d型：目标条带为3条，分别为208bp、263bp和1920bp;d/d型：目标条带为2条，分别为208bp和1920bp;D/D型：目标条带为2条，分别为208bp和263bp;DEL/d：目标条带为4条，分别为102bp、208bp、263bp和1920bp;由图2可知，本实验室所建立的实验方法，具有简便直观，鉴定准确的特点，可以检测出人类RHD基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型，适于大样本量的筛选和检测。图2多重PCR方法检测RHD基因型的电泳图　　Fig.2 Electrophoretogram of RHD genotypes by the multiplex PCRM：Marker(DL2000)，购自TaKaRa公司;1、2：INNO-TRAIN公司的标准物，1为D/d型，2为d/d型;3：D/D型;4：D/d型;5：DEL/d型;6：d/d型;7：DEL/d型;8为d/d型。

　　2.2本方法与商用试剂盒的对照结果应用德国INNO-TRAIN公司和天津市秀鹏生物技术开发有限公司RHD基因检测方法进行相同样本的基因分型(图3、图4)，按照条带布局判断结果，检测结果与本实验室的方法结果相符。与商用试剂盒相比，自建方法只需要在凝胶中加1孔的反应产物电泳后即可判断结果，而商用试剂盒需要8孔通过格局来判断结果，自建方法明显较为简便。图3INNO-TRAIN公司试剂盒RHD基因分型的电泳图Fig.3 Electrophoretogram of RHD genotypes by commercially supplied kit from INNO-TRAIN CompanyA、C：购自INNO-TRAIN公司的标准物;A：D/d型;B：D/D型;C：d/d型;D：d/d型;E、F：DEL/d型。

　　2.3应用本方法检测Rh阴性无偿献血者基因型的结果共筛选了437例西安市Rh阴性无偿献血者的基因型，检出DEL/d基因型88例，占Rh阴性无偿献血者20%，无效D基因型(即有D基因但不表达D抗原，基因型为D/D和D/d)33例，占7.5%。采用本方法可以直观和高通量地检测Rh血型的基因型(图5)。为保证实验的准确性，避免假阴性和假阳性，在检测样本中加入已知RHD基因型的质控样本，图中C1(DEL/d型)、C2(d/d型)和C3(D/d型)即为质控样本，根据其反应结果判断实验结果是否可靠。图4天津市秀鹏公司试剂盒RHD基因分型的电泳图Fig.4 Electrophoretogram of RHD genotypes by commercially supplied kit from Tianjin Biosuper Company图5西安市RhD阴性无偿献血者基因检测的电泳图　　Fig.5 Electrophoretogram of RHD genotypes for RhD negative donor in XianC1：DEL/d型;C2：d/d型;C3：D/d型。

　　3讨论

　　20世纪90年代，随着分子生物学技术的发展，血型基因分型已广泛应用于ABO基因分型。例如胎儿、新生儿血红细胞ABO血型的鉴定[4];由于RH基因的复杂性，RH基因的研究起步较晚，随着科研人员的努力，RH基因的位置和序列都已经被逐步确定下来。Rh抗原是由位于1号染色体短臂上的两个同源及紧密连锁的基因所编码，即RHD和RHCE基因，每个基因都是由10个外显子组成;RHD基因编码D抗原，RHCE基因编码Cc和Ee抗原。RHD和RHCE基因的外显子与内含子有93.8%的同源性。RHD和RHCE基因分别长57295bp和57831bp，两个基因相隔约30kb，尾对尾形成排列(5′RHD3′-3′RHCE5′)，中间隔差一个功能未知的小膜蛋白1基因(SMP1基因)。RHD基因的两端存在有两个具有98.6%同源性的区域被称为Rh盒子(Rh boxes);RhD阴性的RHD基因缺失，两端的Rh boxes基因部分缺失后熔合形成单一杂合Rh盒子(Rh box-hybrid)，成为RhD阴性基因的特征[5]。RHD和RHCE基因的高度相似性使通过分子生物学进行基因检测的难度增加，要建立准确的基因分型的方法，必须要避免相似基因造成的非特异性。因此，设计出的引物必须能够特异性地扩增出RHD基因而非RHCE基因，同时还能够对不同的RHD基因型加以区分。

　　现已发现RhD阴性的个体中存在着一种重要的RhD的弱表现型：DEL(D-elution)型，DEL所占的比例在不同文献报告中不尽相同。国外报告在黑人和日本人中DEL比例较高，约30%～50%，中国人初筛RhD阴性的人群中香港报告DEL占30%，内地占20%～30%[6-7]。DEL血型引起了日益增加的关注主要源于两个方面：一是目前国内外对DEL血型作为RhD阴性血型对待，DEL血液仍用于供给RhD阴性患者使用。但是，国内外都有越来越多的报道证实RhD阴性患者输用DEL血液后，产生了抗-D抗体或体内抗-D抗体效价升高，可能引起输血反应，成为临床输血中的不安全因素;二是DEL表达的D抗原是完整的D抗原，DEL血型的患者是否能够用D阳性血液，从而节约宝贵的RhD阴性血液资源[8]。以上的研究都必须对DEL血型进行准确的鉴定，同时大规模的检测也需要采用可靠、简便和经济的方法才能够进行。因此，我们建立的方法对开展进一步的研究具有实际价值。

【参考文献】
[1]AVENT ND, REID ME. The Rh blood group system: a review \[J\]. Blood, 2000, 95(2):375-387.
[2]SHAO CP, MAAS JH, SU YQ, et al. Molecular background of Rh D-positive, D-negative, Del and weak D phenotypes in Chinese \[J\]. Vox Sang, 2002, 83(2):156-161.
[3]WAGNER FF, FLEGEL WA. Review: the molecular basis of the Rh blood group phenotypes \[J\]. Immunohematology, 2004, 20(1):23-36.
[4]岳亚飞，邱洪涛，赵亚娟，等. PCR-SSP法检测胎儿、新生儿ABO血型 \[J\]. 西安交通大学学报：医学版, 2003, 24(4):403-405.
[5]WAGNER FF, FLEGEL WA. RHD gene deletion occurred in the rhesus box \[J\]. Blood, 2000, 95(12):3662-3668.
[6]YE L, YUE DL, WO DQ, et al. Molecular bases of unexpressed RHD alleles in Chinese D-persons \[J\]. Transfusion, 2009, 49(8):1655-1660.
[7]郭如华，邢培清，徐雅琴，等. 河南省部分RhD(-)献血者RhD基因多态性分析 \[J\]. 郑州大学学报：医学版, 2002, 37(2):210-212.
[8]WAGNER T, KORMOCZI GF, BUCHTA C, et al. Anti-D immunization by DEL red blood cells \[J\]. Transfusion, 2005, 45(4):520-526.

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周锦帆