药品中一般杂质检查项目与方法介绍二
一、重金属检查法
重金属系指在实验条件下能与硫代乙酰胺或硫化钠作用显色的金属杂质。如银、铅、汞、铜、镉、铋、锡、砷、锑、镍、钴锌等。药物中重金属的存在影响药物的稳定性及安全性。因生产中遇到铅的机会较多,且铅在体内又易积蓄中毒,故以铅作为重金属的代表。《中华人民共和国药典》(2015)收载了重金属检查的三种方法。
1.第一法(硫代乙酰胺法)
本法用于溶于水、稀酸和乙醇的药物。
(1)原理
硫代乙酰胺在弱酸性(pH3.5)条件下水解,产生硫化氢,与重金属离子生成黄色到棕黑色的硫化物混悬液,与一定量标准铅溶液经同法处理后所呈颜色比较,判断供试品中重金属是否符合限量规定。
(2)操作方法
除另有规定外,取25ml纳氏比色管3支,甲管中加标准铅溶液一定量与醋酸盐缓冲液(pH3.5)2ml后,加水或各药品项下规定的溶剂稀释成25ml,乙管中加入按各药品项下规定的方法制成的供试液25ml,丙管中加入与乙管相同量的供试品,加配制供试品溶液的溶剂适量使溶解,再加与甲管相同量的标准铅溶液与醋酸盐缓冲液(pH3.5)2ml后,用溶剂稀释成25ml;若供试液带颜色,可在甲管中滴加少量的稀焦糖溶液或其他无干扰的有色溶液,使之与乙管、丙管一致;再在甲、乙、丙三管中分别加硫代乙酰胺试液各2ml,摇匀,放置2min,同置白纸上,自上向下透视,当丙管中显出的颜色不浅于甲管时,乙管中显出的颜色与甲管比较,不得更深。如丙管中显出的颜色浅于甲管,应取样按第二法重新开始;如在甲管中滴加稀焦糖溶液或其他无干扰的有色溶液,仍不能使颜色一致时,应取样按第二法检查。
(3)测定条件
①标准铅溶液的制备 称取硝酸铅0.1599g,置1000ml量瓶中,加硝酸5ml与水50ml溶解后,用水稀释至刻度,摇匀,作为贮备液。精密量取贮备液10ml,置100ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,即得(每1ml相当于10μg的Pb)。本液仅供当日使用。配制与贮存用的玻璃容器均不得含铅。
②在测定条件下,适宜目视比色的浓度范围为每27ml溶液中含10～20μg的Pb2+,相当于标准铅溶液1.0～2.0ml。
③检查是在醋酸盐缓冲溶液(pH3.5)2ml中进行。在pH3～3.5时,硫化铅沉淀较完全。酸度增大,重金属离子与硫化氢呈色变浅,酸度太大时甚至不显色。
④供试品如含高铁盐影响重金属检查时,可在甲、乙、丙三管中分别加入相同量的维生素C 0.5～1.0g,再照上述方法检查。配制供试品溶液时,如使用的盐酸超过1.0ml,氨试液超过2ml,或加入其他试剂进行处理者,除另有规定外,甲管溶液应取同样同量的试剂置瓷皿中蒸干后,加醋酸盐缓冲液(pH=3.5)2ml与水15ml,微热溶解后,移置纳氏比色管中,加标准铅溶液一定量,再用水或各种项下规定的溶剂稀释成25ml。
2.第二法
适用于含芳环、杂环以及不溶于水、稀酸及乙醇的有机药物
(1)原理
重金属可与芳环、杂环形成较牢固的价健,可先炽灼破坏,所得残渣加硝酸进一步破坏,蒸干。再加盐酸转化为易溶于水的氯化物,再按第一法检查。
(2)操作方法
除另有规定外,必须改用第二法检查时,取各项下规定量的供试品,按炽灼残渣检查法进行炽灼处理,然后取遗留的残渣;或直接取炽灼残渣项下遗留的残渣;如供试品为溶液,则取各品种项下规定量的溶液,蒸发至干,再按上述方法处理后取遗留的残渣;加硝酸0.5ml,蒸干,至氧化氮蒸气除尽后(或取供试品一定量,缓缓炽灼至完全炭化,放冷,加0.5～1.0ml,使恰湿润,用低温加热至硫酸除尽后,加硝酸0.5ml,蒸干,至氧化氮蒸气除尽后,放冷,在500～600℃炽灼使完全灰化),放冷,加盐酸2ml,置水浴上蒸干后加水15ml,滴加氨试液至对酚酞指示液显微粉红色,再加醋酸盐缓冲液(pH3.5)2ml,微热溶解后,移置纳氏比色管中,加水稀释成25ml,作为甲管;另取配制供试品溶液的试剂,置瓷皿中蒸干后,加醋酸盐缓冲液(pH3.5)2ml与水15ml,微热溶解后,移至纳氏比色管中,加标准铅溶液一定量,再用水稀释成25ml,作为乙管;再在甲、乙两管中分别加硫代乙酰胺试液各2ml,摇匀,放置2min,同置白纸上,自上向下透视,乙管中显出的颜色与甲管比较,不得更深。
3.第三法
适用于溶于碱而不溶于稀酸或在稀酸中即生成沉淀的药物。
(1)原理
在碱性介质中,以硫化钠为显色剂,Pb2+与S2-作用生成PbS微粒混悬液,与一定量标准铅溶液经同法处理后所呈颜色比较。
(2)操作方法
除另有规定外,取供试品适量,加氢氧化钠试液5ml与水20ml溶解后,置纳氏比色管中,加硫化钠试液5滴,摇匀,与一定量的标准铅溶液同样处理后的颜色比较,不得更深。
除另有规定外,取25ml纳氏比色管3支,甲管中加标准铅溶液一定量与醋酸盐缓冲液(pH3.5)2ml后,加水或各药品项下规定的溶剂稀释成25ml,乙管中加入按各药品项下规定的方法制成的供试液25ml,丙管中加入与乙管相同量的供试品,加配制供试品溶液的溶剂适量使溶解,再加与甲管相同量的标准铅溶液与醋酸盐缓冲液(pH3.5)2ml后,用溶剂稀释成25ml;若供试液带颜色,可在甲管中滴加少量的稀焦糖溶液或其他无干扰的有色溶液,使之与乙管、丙管一致;再在甲、乙、丙三管中分别加硫代乙酰胺试液各2ml,摇匀,放置2min,同置白纸上,自上向下透视,当丙管中显出的颜色不浅于甲管时,乙管中显出的颜色与甲管比较,不得更深。如丙管中显出的颜色浅于甲管,应取样按第二法重新开始检查。如在甲管中滴加稀焦糖溶液或其他无干扰的有色溶液,仍不能使颜色一致时,应取样按第二法检查。
二、砷盐检查法
砷盐多由药物生产中使用的无机试剂及搪瓷反应器引入,砷为毒性杂质,须严格控制其量。
1.古蔡氏检砷法
(1)原理
金属锌与酸作用产生新生态氢,将药物中微量砷还原为砷化氢,当砷化氢气体遇溴化汞纸时,根据含砷量不同产生黄色至棕色的砷斑,与同一条件下定量标准砷溶液所生成的砷比较判定供试品砷盐是否符合限量规定。
(2)操作方法
①标准砷斑的制备 精密量取标准砷溶液2ml,置A瓶中,加盐酸5ml与水21ml,再加碘化钾试液5ml与酸性氯化亚锡试液5滴,在室温放置10min后,加锌粒2g,立即将照上法装妥的导气管密塞于A瓶上,并将A瓶置25~40℃水浴中,反应45min,取出溴化汞试纸,即得。
若供试品需经有机破坏后再行检砷,则应取标准砷溶A液代替供试品,照该药品种项下规定的方法同法处理后,依法制备标准砷斑。
②检查法 于导气管中装入醋酸铅棉花60mg(装管高度为60～80mm),再于旋塞的顶端平面上放一片溴化汞试纸(试纸大小以能覆盖孔径而不露出平面外为宜),盖上旋塞盖并旋紧。取按各药品项下规定方法制成的供试液,置A瓶中,照标准砷斑的制备,自“再加碘化钾试液5ml”起,依法操作。将生成的砷斑与标准砷斑比较,不得更深。
(3)测定条件
①标准砷溶液的制备称 取三氧化二砷0.132g,置1000ml量瓶中,加20%氢氧化钠溶液5ml溶解后,用适量的稀硫酸中和,再加稀硫酸10ml,用水稀释至刻度,摇匀,作为贮备液。临用前,精密量取贮备液10ml,置1000ml量瓶中,加稀硫酸10ml,用水稀释至刻度,摇匀,即得(每1ml相当于1μg的As)。
②标准砷斑应用2ml标准砷溶液制成。药物含砷限量不同,可按规定限量改变供试品取用量,不可改变标准砷溶液取量。
③因为As5+生成砷化氢的速度慢,在反应液中加入还原剂酸性氯化亚锡及碘化钾,将供试品中可能存在的As5+还原为As3+;氧化生成的碘又被氯化亚锡还原为碘离子,与反应中产生的锌离子形成稳定的络离子,使生成砷化氢的反应不断进行。
④供试品及锌粒中可能含有少量硫化物,在酸性条件下将产生硫化氢气体。该气体遇溴化汞试纸生成硫化汞色斑,产生假阳性,干扰试验结果。采用醋酸铅棉花,可预先吸收硫化氢,避免其与溴化汞试纸作用。醋酸铅棉花用量太少,可能除不尽硫化氢,太多或塞得太紧会阻碍砷化氢的通过。所以药典规定取醋酸铅棉花60mg,装管高度为60～80mm,这样即使在1000μg硫存在下也不干扰测定。
(4)注意事项
①若供试品为硫化物、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等,在酸性溶液中生成硫化氢或二氧化硫气体,与溴化汞作用生成黑色硫化汞或金属汞,干扰比色。应先加硝酸处理,使氧化成无干扰的硫酸盐,过量的硝酸及产生的含氮氧化物应蒸干除尽。
②供试品若为铁盐,不仅消耗还原剂,影响测定条件,且能氧化砷化氢。应该先加酸性氯化亚锡试液,将Fe3+还原为Fe2+,再依法检查。
③供试品若为强氧化剂或在酸性溶液中能产生强氧化性物质者,如亚硝酸钠在酸性溶液中能产生亚硝酸和硝酸,不仅消耗锌粒且产生含氮的氧化物氧化新生态的氢,影响砷化氢的生成。因此,需加入硫酸先行分解后依法测定。
④具环状结构的有机药物,因砷可能以共价键与其结合,需进行有机破坏后再检查,常用的有机破坏法有碱破坏法和酸破坏法。
若供式品需经有机破坏后再行检砷,则制备标准砷斑时,应取标准砷溶液2.0ml代替供试品,照各品种项下规定的方法同法处理后,依法制备标准砷斑。
⑤砷斑遇光、热及湿气则褪色。如需保存可将砷斑在石蜡饱和的石油醚溶液中浸过晾干或避光置于干燥器内,也可将砷斑用滤纸包好夹在记录本中保存。
2.二乙基二硫代氨基甲酸银法(Ag-DDC)
该法不仅可用于限量检查,也可用作微量砷盐的含量测定。
(1)原理
金属锌与酸作用产生新生态氢,与微量砷盐反应,生成具挥发性的砷化氢,砷化氢与二乙基二硫代氨基甲酸银(Ag-DDC)作用,游离出银,此胶态的银呈红色,与同条件下一定量标准砷溶液所产生的颜色比较,或在510nm波长处测定吸光度,以判断砷盐限量。
(2)操作方法
①标准砷对照液的制备 精密量取标准砷溶液5ml,加盐酸5ml与水21ml,再加碘化钾试液5ml与酸性氯化亚锡试液5滴,在室温放置10min后,加锌粒2g,立即将导气管与A瓶密塞,使生成的砷化氢气体导入另一D管中,并将A瓶置25～40℃水浴中反应45min,取出D管,添加氯仿至刻度,混匀,即得。
若供试品需经有机破坏后再行检砷,则应取标准砷溶液代替供试品,照各药品项下规定的方法同法处理后,依法制备标准砷对照液。
②检查法 于导气管中装入醋酸铅棉花60mg(装管高度约80mm),并于D管中精密加入二乙基二硫代氨基甲酸银试液5ml。取照各药品项下规定方法制成的供试液置A瓶中,照标准砷对照液的制备,自“再加碘化钾试液5ml”起,依法操作。将所得溶液与标准砷对照液同置白色背景上,从D管上方向下观察、比较,所得溶液的颜色不得比标准砷对照液更深。必要时,可将所得溶液转移至1cm吸收池中,用适宜的分光光度计或比色计在510nm波长处以二乙基二硫代氨基甲酸银试液做空白,测定吸收度,与标准砷对照液按同法测得的吸收度比较,即得。
三、硫化物检查法
硫化物为有毒物质。检查原理:是利用硫化物与盐酸作用产生硫化氢气体,遇醋酸铅试纸产生棕色的硫化铅“硫斑”,与一定量标准硫化钠溶液在相同条件下生成的硫斑比较,判断供试品中硫化物是否符合限量规定。
仪器装置同古蔡法检砷装置,但导气管中不装醋酸铅棉花,溴化汞试纸改用醋酸铅试纸。反应温度为80～90℃水浴中加热10min。
四、硒盐检查法
药物中混入的微量硒主要来自生产中使用的试剂。元素状态的硒无毒,但硒化物(二氧化物)有剧毒,因此对有可能引入硒的药物要对残留硒进行限量检查。检查时先将有机药物用氧瓶燃烧法进行有机破坏,使硒成为高价氧化物(SeO3),被硝酸溶液吸收,再用盐酸羟胺将Se6+还原为Se4+,在pH=2.0±2的条件下,加二氨基萘试液反应100min,生成4,5-苯并苯硒二唑,用环己烷提取后在378nm波长处测定吸光度,结果应不大于对照液的吸收度。
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