反向PCR （inverse-PCR）
实验方法原理
反向PCR是克隆T-DNA插入位点侧翼DNA序列非常有效的方法。
1. 选择合适的限制性内切酶位点。并在T-DNA的边界（左边界、右边界均可）和酶切位点附近设计引物P1、P2；
2. 回收DNA，T4连接酶连接，使酶切后的DNA片段环化；
3. 回收连接后的DNA，用引物P1、P2做PCR，就可扩增到两端为T-DNA插入序列，中间为侧翼序列的片段。
实验材料 DNA样品
试剂、试剂盒 T4 DNA连接酶（T4 DNALigase）引物EcoR I ddH2O 酚氯仿无水乙醇乙酸钠
仪器、耗材 电泳仪离心管离心机超净台水浴锅
| 实验步骤 | 一、限制性内切酶消化 1. 选择合适的限制性内切酶，基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前，应对基因组DNA定量。 2. 根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位点上游附近设计引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用这些内切酶分别消化基因组DNA，酶切体系如下：
1. 将酶切产物转到1.5 ml离心管中，用ddH2O洗涤干净，并稀释到250 μl； 2. 加入等体积的酚和氯仿（V：V=1：1），涡旋混匀，室温静置1 min； 3. 最大速度（13 000 rpm）离心1 min； 4. 将上清移到另一管中，加入等体积的氯仿，涡旋混匀，室温静置1 min； 5. 最大速度（13 000 rpm）离心2 min； 6. 将上清移到另一管中，加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，0.1倍体积的3 M 乙酸钠（pH=5.2），轻轻振荡混匀，室温静置5 min； 7. 4℃最大速度（13 000 rpm）离心10~15 min； 8. 弃上清，尽量除去管壁上的液体； 9. 加入1 ml -20℃预冷的70%乙醇，轻轻颠倒几次。最大速度（13 000 rpm）离心5 min； 10. 除去乙醇，在超净台上平放，将管壁上的乙醇挥发掉，20~40 μl ddH2O溶解。-20℃保存。 三、连接
2-14℃ 过夜 2. 连接体系比较大，而DNA含量比较低，不需加入PEG4000，这样可以促进分子内的连接，减少分子间的连接。试验中我们采取蹇文婴等（2002）的方法（12-14℃连接48 h）。连接完成后，65℃ 水浴10 min灭活。按上述3.抽提回收，溶解于40 μl ddH2O中。
3. 然后就可以用回收的链接片段做PCR了。 |
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