杆状病毒系统蛋白质表达实验——蛋白质生产高峰期的确定
| 实验方法原理 | 因为重组蛋白的表达受多角体启动子的调节，而多角体启动子在病毒裂解循环的晚期才被激活，所以重组蛋白在感染后期才表达。重组蛋白通常在感染后 15～24 h之间即可检测到，并可积累至感染后 40 h 左右，然后积累水平下降。由于不同的蛋白质在昆虫细胞中有不同的稳定性，推荐用这个系统测定蛋白质积累的时间效应。 |
|---|---|
| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | TNM-FH昆虫培养基60 mm 组织培养皿27℃ 培养箱（湿度可选）15 ml 聚丙烯离心管Beckman GPR 离心机沸水浴／100℃加热板超声仪 |
| 实验步骤 | 1. 分别接种 3 × 105 细胞于 15 个盛有 3 ml 含 10% 胎牛血清的 TNM-FH 培养基的 60 mm 组织培养皿中。27℃ 温育 1 h，使细胞贴壁。然后每次均以感染复数（MOI）为 10 的量，用野生型病毒感染 7 个培养皿，用重组病毒感染 7 个培养皿，剩余的一个培养皿为非感染对照。 另外，也可用 3 个 100 ml 旋转培养瓶悬浮培养 Sf 9 细胞。当细胞达到 1.5 × 106 细胞/ml的密度时，一个以重组病毒感染，另一个用野生型病毒感染，感染复数为1～2，剩下的一个作为非感染培养物对照。 2. 在感染后的不同时间（从感染后约 15～72 h）收获细胞，感染后 15 h 收获非感染细胞：将细胞和培养物上清转移至离心管，4℃ 1000 g 离心 10 min，收获细胞。 3. 按照基本方案 1，处理并分析细胞（非分泌型重组蛋白）或上清（分泌型重组蛋白)。 展开 |
| 注意事项 | 如果细胞悬浮培养，则在每一时间点取出 2 ml 的小份培养物，采用与单层培养同样的方法处理细胞和上清液。 |
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