紫外分光光度法测定鱼肝油中维生素A的含量
一、原理
维生素A的异丙醇溶液在325nm波长处有最大吸收峰，其吸光度与维生素A的含量成正比。
二、试剂
维生素A标准溶液：视黄醇85%（或视黄醇乙酸脂90%）经皂化处理后使用。称取一定量的标准品，用脱醛乙醇溶解使其浓度大约为1mg/mL。临用前需进行标定。取标定后的维生素A标准溶液配制成10 I.U/mL的标准使用液。
标定：取维生素A溶液若干微升，用脱醛乙醇稀释3.00Ml，在325nm处测定吸光度，用此吸光度计算出维生素A的浓度。
C——维生素A的浓度g/mL
A——维生素A的平均吸光度值
S——加入的维生素A溶液量µL
E——1%维生素A的比吸光系数：
无水脱醛乙醇：取2g硝酸银溶入少量水中。取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入盛有1L乙醇的试剂瓶中，振摇后，暗处放置两天（不时摇动促进反应）。取上层清液蒸馏，弃去初馏液50mL。
酚酞：用95%乙醇配制成1%的溶液。
1:1氢氧化钾；0.5mol/L 氢氧化钾；无水乙醚：不含过氧化物；异丙醇
三、操作步骤
1、样品处理
皂化：称取0.5-5g充分混匀的鱼肝油于三角瓶中，加入10mL1:1氢氧化钾及20-40mL乙醇，在电热板上回流30分钟。加入10mL水，稍稍振摇，若有混浊现象，表示皂化完全。
提取：将皂化液移入分液漏斗，先用30mL水分两次洗涤皂化瓶（若有渣，可用经过脱脂棉过滤），再用50mL**分两次洗涤皂化瓶，所有洗液并入分液漏斗中，振摇两分钟（注意放气），静止分层后，水层放入第二分液漏斗。皂化瓶再用30mL**分两次洗涤，洗液倒入第二分液漏斗，振摇后静止分层，将水层放入第三分液漏斗，醚层并入第一分液漏斗。重复操作3次。
洗涤：向第一分液漏斗的醚液中加入30mL水，轻轻振摇，静止分层后放出水层。再加15-20mL0.5mol/L的氢氧化钾溶液，轻轻振摇，静止分层后放出碱液。再用水同样操作至洗液不使酚酞变红为止。醚液静止10-20分钟后，小心放掉析出的水。
浓缩：将醚液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约25mL**洗涤分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶中。用水浴蒸馏回收乙醚，待瓶中剩余约5mL**时取下减压抽干，立即用异丙醇溶解并移入50mL容量瓶中用异丙醇定容。
2、绘制标准曲线
分别取维生素A标准使用液0.00,1.00,2.00,3.00,4.00,5.00mL于10mL容量瓶中用异丙醇定容。以零管调零，于紫外分光光度计上在325nm处分别测定吸光度，绘制标准曲线。
3、样品测定
取浓缩后的定容液于紫外分光光度计上在325nm处测定吸光度，通过此吸光度从标准曲线上查出维生素A的含量。
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