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牛奶中抗生素残留的确证

2020.3.06

有害残留物的分析检测应该做到快速、安全和经济，但技术上实现起来有很大难度。而将微阵芯片技术与多溶质免疫测定法相结合可以兼顾这三方面。慕尼黑工业大学（TUM）的科学家们，与路德维希-马克西米利安慕尼黑大学（LMU）以及慕尼黑GWK-精密制造公司共同合作, 开发了一种全自动的微型实验室，能够快速、可靠地用于牛奶中抗生素残留物的确证。

对奶牛施用抗生素不是一个好办法，但有时却又不得不这样做，生态农业也经常有这样的情况。牛奶中的抗菌剂残留物可能对消费者带来健康风险，并由此导致乳品质量安全事故，以及对问题产品的清除，这些都会让乳品和食品经济遭受严重损失。整个欧洲乳品经济每年因乳品安全事故产生的损失高达2亿欧元。欧盟为保护消费者，对抗生素含量进行了规定，但迄今为止，用于确证牛奶中所使用的抗生素残留的检测方法，既复杂又不完备。

为了规避风险，降低损失，欧盟采取的方式是，将交货的牛奶在奶场加以控制，并通过第三方检测实验室另行检验。这里主要通过微生物抑制剂试验完成，如果牛奶样品抑制了试验细菌的生长，则须怀疑抗生素残留物有可能存在于牛奶中，然后就要采取复杂的方法进一步分析确证。这种方法的缺点在于：耗时长达3h以上，且不能对药物作出准确的鉴定和定量分析。另外，还有一种受体快速测试法，但需要一系列手工操作步骤，而且只能确证出一些单个的抗生素组群。

图2. 多溶质免疫分析法定量测定牛奶中抗生素的原理。

基于微阵芯片的检测系统

乳品制造商和奶场的进货控制室都希望能够获得尽可能多的有关药物残留分析方面的信息。为此，慕尼黑工业大学（TUM）分析化学教研室会同路德维希-马克西米利安慕尼黑大学牛奶卫生与技术教研室的科技人员，开发了一种玻璃芯片和全自动的分析平台，可以对14种重要的抗生素进行平行、可靠的确证。科技人员利用了一种抗原/抗体-反应：在玻璃板上印制了具有不同待测抗生素的斑点，形成一种微阵芯片。往待测的牛奶样品中加入针对该抗生素具有专属反应的抗体混合物，如果某种抗生素存在于牛奶样品中，它就会与相应的抗体发生反应。抗生素的浓度越高，与该抗生素反应的抗体就越多，剩余的未反应的抗体与芯片上的抗生素斑点相结合，这些二级抗体通过辣根过氧化物酶标记，这种酶在发光氨和过氧化氢的存在下能够在每个单个斑点区激发一种化学荧光反应。借助于这种化学发光反应，就像法医学中的血迹确证原理那样，在那些有最多抗体结合的地方，出现最亮的发光点。如果牛奶中存在某种抗生素，则只有较少的抗体可供使用，于是相应的点就显得暗淡（见图2）。采用电荷耦合式摄像机（CCD相机）对光的强度进行测量，不仅能够证明牛奶样品中是否含有抗生素，而且还能显示其含量。这种技术的优点在于可以测定牛奶中含有的多种抗生素的含量，借此追溯到所使用的药物。

目前，路德维希-马克西米利安慕尼黑大学已经成功开发了一种对抗生素具良好选择性的单克隆抗体。

图3. 一种抗生素-微阵芯片分析的化学荧光图像：左图为不含抗生素的牛奶样品；右图为被560μg/L青霉素G污染了的牛奶样品（法定最大残留量MRL=4μg/L）。

全自动微型实验室

慕尼黑工业大学与慕尼黑GWK-精密制造公司合作，开发了全自动的微型实验室 MCR-3（第3代慕尼黑芯片阅读机），将其与微阵芯片结合便可确证原料奶中的抗生素是否已经超标。整个分析平台的组成包括：一个由泵和阀组成的精确控制测量进程的液路；一个含有抗生素微阵芯片和与液路连接的微液路电子芯片；一个检测模块；一个自动进样器和一个用于对过程进行控制和对微阵成像分析求值的集成软件。采用这一系统，无需对原料奶进行样品前处理，就能于5min之内得到14种以上抗生素的定量信息。

此外，这种抗生素微阵芯片还具有可再生性，通过一种特殊的缓冲溶液，可以将抗体从芯片表面洗掉，可供下次使用。再生芯片可以重复使用50次，如果在同一工作日对每块微阵芯片进行一次内部校正，可分析50个牛奶样品，而无需更换微阵芯片，从而降低了每次的分析成本。这也使得这种微型实验室成为全球用于牛奶中抗生素分析最快速、最实惠的分析系统。

此外，该系统的分析精密度还通过在牛奶中加入经由低压冻干的、多溶质校正标准物质而得到进一步提高。这种多溶质校正标准物质系由慕尼黑AiM公司所制备，首次于MCR-3 微型实验室仪器上结合实际样品进行了验证性试验，该试验由巴伐利亚州牛奶监测站（MPR）完成。同时，作为互补性参考分析，坎普顿Muva公司还建立了质谱测定法作为比对。

实验结果表明，β-内酰胺、磺胺类药、喹诺酮、大环内脂和氨基糖苷类抗生素等14种最重要的抗生素，均可于5min之内同时定量测出（见图3）。各种单个的免疫测定法皆如此进行了优化，使得法定最大残留物量（最大残留水平 MRL）尽量位于校正曲线的工作范围之内（见表1）。一部分抗体显示出过高的敏感度，以致在得到阳性结果时，还要采用稀释后的样品重新测定。抗体-微阵芯片批次间的变异系数大约为30%，与之相反，芯片本身的变异系数仅为10%，这就意味着，每个芯片在用于测定之前必须采用多溶质标准物质加以校正，以保证测量结果的高重现性。

同时定量测定14种抗生素

自2008年以来，在巴伐利亚州牛奶监测站业已采用MCR-3微型实验室分析了对抑制剂呈阳性结果的2408个牛奶样品，并给出了原料奶中14种实际可检出的抗生素的初步含量信息。其中93%的实际样品测定结果与BRT-分析结果相一致。发现了氨苄青霉素、氯唑西林，青霉素G/链霉素、氯唑西林/氨苄青霉素,青霉素G/新霉素B等单个抗生素的残留物，其中青霉素G以72%的比例被最频繁地作为抗生素使用。