下呼吸道感染的微生物学检验
下呼吸道包括气管、支气管、细支气管、细支气管末端进入肺泡。下呼吸道标本的微生物学检验由于受上呼吸道正常寄生菌群的影响，结果往往难于正确判断，存在各种各样的问题，有必要加以关注。
在健康人群口、鼻咽部寄居的微生物种类繁多（见表1），可条件致病，引起下呼吸道感染。
表1 在健康人群的口、鼻咽部寄居的微生物
可能的条件致病微生物 | 少见的条件致病微生物 |
| 不动杆菌、绿色链球菌（包括米氏链球菌）、β溶血链球菌、肺炎链球菌、金苗色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌、支原体、流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、卡它莫拉菌（布兰汉）、白色念珠菌、单纯疱疹病毒、肠杆菌科细菌、分枝杆菌、假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌（假单胞菌）、丝状真菌、臭鼻克雷伯菌、啮蚀艾肯菌、拟杆菌、消化链球菌、放线菌、嗜沫嗜血杆菌、龈内阿米巴、毛滴虫 | 非溶血性链球菌、葡萄球菌、微球菌、棒杆菌、奈瑟菌（除淋病、脑膜炎奈瑟菌）、乳牛杆菌、韦荣球菌、螺旋体、龋齿罗氏菌、口腔纤毛菌、月形单胞菌、粘液性口腔球菌、弯曲菌 |
细菌致病首先要在呼吸道取得一个立足点，粘附在组织黏膜上，生长繁殖到足够数量才能致病。用避免污染的方法从下呼吸道无菌部位分离到的细菌（见表2）无论数量多少均应报告医生。
表2 呼吸道病原体
| 肯定的呼吸道病原体 | 少见的呼吸道病原体 |
| 白喉棒状杆菌（产毒素）、结核分枝杆菌、肺炎支原体、沙眼衣原体、肺炎衣原体（TWAR）、百日咳鲍特菌、军团菌、卡氏肺囊虫、诺卡菌、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、新型隐球菌（可从未发病的病人中发现）、皮炎芽生菌、病毒（呼吸道合胞病毒、腺病毒、肠病毒、单纯疱疹病毒、流感病毒、副流感病毒、鼻病毒—） | 土拉热弗朗西丝菌、炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、伯克霍尔德（假单胞）菌、伯氏考克斯体、鹦鹉热衣原体、布鲁菌、沙门菌、多杀巴斯德菌、鼻硬结克雷伯菌、水痘-带状疱疹病毒、寄生虫 |
表3 急性支气管炎的主要病原体
| 细菌 | 病毒 |
百日咳鲍特菌 副百日咳鲍特菌 流感嗜血杆菌 肺炎支原体 肺炎衣原体 | 副流感病毒 流感病毒 呼吸道合胞病毒 腺病毒 麻疹病毒 |
一、下呼吸道感染性疾病
1．急性气管炎 通常由细菌和病毒引起（见表3），婴儿和学龄前儿童的急性气管炎要考虑百日咳杆菌感染，最好的检验样品是深部鼻咽拭。
2．慢性气管炎 查找病原体往往较困难，流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、卡它莫拉菌属往往能从这些患者的支气管中分离到。病毒往往也是一个致病原。
3．肺炎 门诊和住院病人中，肺炎往往是疾病和死亡的一个因素，也是院内感染的一个重要方面。上呼吸道感染浸入肺部、直接吸入病原体或由血流入肺，均可引起肺炎。成人肺炎的常见病因有肺炎支原体、呼吸道病毒、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、需氧革兰阴性杆菌、金黄色葡萄球菌及军团菌。肺炎链球菌是成人肺炎最常见的病因。
病毒也能引发肺部细菌感染。 在美国，肺炎的死亡率排第6位。婴儿和儿童80%以上肺炎是由病毒引起，由病毒素引起的成年人肺炎小于10%-20%。由细菌引起的儿童肺炎往往是流感嗜血杆菌、肺炎链球菌或金黄色葡萄球菌。新生儿可由沙眼衣原体或卡氏肺囊虫所致。在小于30岁的年轻人中，肺炎支体是最重要的下呼吸道病原体，最近发现肺炎衣原体也是重要的致病原，在病毒性肺炎后经常继发β-溶血性链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、卡它莫拉菌、流感嗜血杆菌、肺炎链衣原体感染。在成年人下呼吸道感染中不多见的病原体包括放线菌和诺卡菌属，其他就更少。
4．医院获得性肺炎：该类肺炎病死率很高，是住院病人、尤其是插管病人的一外危险因素。感染菌倾向于医院专门化，最常见的是克雷伯菌、肠杆菌科细菌、金黄色葡萄球菌、厌氧菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌和军团菌感染。在儿童医院内感染中，呼吸道合胞病毒、腺病毒素、流感A病毒往往是病原体。慢性下呼吸道感染 结核分枝杆菌、真菌、厌氧菌、囊纤维变性可导致肺部持续性细菌感染，恶性肿瘤病人尤其容易被细菌感染，其病原体种类见表4。
表4 某些恶性肿瘤患者经常易感的病原体
| 恶性肿瘤（微生物感染部位与类型） | 病原体 |
急性非淋巴细胞性白血病（肺炎、口腔病灶、尿路感染、肝炎、败血症）急性淋巴细胞白血病（肺炎、皮肤灶、咽炎、播散性疾病）
淋巴瘤（播散布性疾病、肺炎、尿路感染、败血症、皮肤病灶）
多发性骨髓瘤（肺炎、皮肤病灶、败血症） | 肠杆菌、假单胞菌、葡萄球菌、杰氏棒杆菌、念珠菌、曲霉菌、毛霉菌、丙型肝炎病毒及其他非甲非乙型肝炎病毒 各型链球菌、卡氏肺囊虫、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒 布鲁菌、念珠菌、新型隐球菌、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、卡氏肺囊虫、龚地弓形虫、产单核细胞李斯特菌、分枝杆菌、诺卡菌、沙门菌、葡萄球菌、肠杆菌科细菌、假单胞菌、粪类圆线虫 流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、肠杆菌科细菌、假单胞菌、水痘-带状疱疹病毒、念珠菌、曲菌 |
器官移植病人在移植后4个月后，特别是第1个月内最易感染，感染常发生在肺部。爱滋病病人也是肺炎的高危人群。
二、样品收集和运送
深咳痰（收集前漱口）、气管刷和洗出液、肺泡灌洗液等样品收集于消毒容器，收集后快速送实验室检验。
1. 深咳痰 深咳痰样品应作革兰染色镜检，观察样品是否适合作培养，考虑结核需作抗酸染色。除非用侵入性技术，不然下呼吸道分泌物易为上呼吸道分泌物、尤其是唾液污染。好的样品取决于病人的理解和采样者所受的教育。痰作为培养标本适用性很差，但却是数量最多、最费时的标本。告诉病人要深咳痰，事先用盐水漱口，尽量少沾唾液。痰咳入消毒容器，立刻送实验室检验，室温下中等程度的延迟（>2h）将失去某些病原菌的检出机会。
2. 诱导痰 不能深咳痰的病人可由呼吸科医生用体位引流和胸腔叩击刺激产生合乎要求的痰，气溶胶诱导是一个替代方法。在分枝杆菌和感染的疾病中，诱导痰对分离病原菌很有用，在卡氏肺囊虫感染病例中也有很高的阳性率。病人吸入的气溶胶雾由15%NaC1和10%甘油溶液产生，吸入约10min，可激发强烈的咳嗽反射。以这样方式获得的痰标本因为含有直接来自肺泡的分泌物，往往呈水样，类似唾液。这种标本不必预检是否合格，微生物实验室就可以直接用于培养，而且避免了侵入性取样。
3. 气管内或气管切开术吸出样品 气管切开病人不能用正常方式取痰，但可方便地从路肯氏曲管装置中收集，与痰同样处理。由于这类病人很容易为革兰氏阴性条件致病菌和其它医院内感染菌感染而引起肺炎，要确认这些病人的肺炎病原菌往往使微生物学家和医生深感困难。
4. 支气管镜洗出样品、保护性支气管刷采集样品和肺泡灌洗液 这类标本仍旧可以被上呼吸道正常寄生菌（草绿色链球菌、奈瑟菌属）污染，但与痰标本相比，更具有诊断上的价值。肺泡灌洗液一般灌洗量为100-300ml生理盐水，在急性细菌性肺炎时，细菌数应大于103-4/ml。支气管刷样品是非常合适的微生物学检验样品，刷取物混悬于1ml液体培养基，剧烈振摇后取0.01ml接种平皿，液体培养基稀释悬浮后若菌落计数≥103/ml可以考虑感染成立。
三、样品检验
1. 直接镜检 寄生虫可由湿片镜检（肺囊虫由专门方法镜检）。加10%HOH在相差显微镜下可检查真菌或用希夫高碘酸钠染片置紫外光下检查真菌。样品必须固定后作革兰染色镜检，同时评估痰质量。可接受的痰标本在低倍镜下（100×）每视野鳞状上皮细胞<25，白细胞并无大的关联，但每视野多形核白细胞≥25，外加较少的鳞状上皮细胞则提示这是一个优秀的样品。以往只有深咳痰样品需要镜检决定是否为合格标本，最近气管的吸出标本也用镜检筛选，成年人每视野（100×）鳞状上皮细胞>25的样品不适合培养，油镜下（1000×）未见细菌也可以不再作进一步微生物学检查。呼吸道分泌物有时需离心，取沉淀作镜检和培养，例如查找结核分枝杆菌。作结核分枝杆菌染色镜检时，金胺罗丹明荧光染色后的片子还可以用传统的抗酸染色再次复检，但片子的复柏油必须在染色前用二甲苯仔细地除去。如存在隐子囊孢子菌呼吸道感染，在抗酸染色后的片子中也可检查出来，这在免疫低下的病人中时有发生。免疫低下病人经常有卡氏肺囊虫感染的危险性，虽然改良Gomori六亚甲四胺银染色传统用于诺卡菌、放线菌、霉菌、寄生虫的识别，但操作需1h，不适用急症。许多实验室使用甲苯胺蓝0快速染色来替代，结果尚可，它检测技术不仅是肺囊虫而且也检出星形诺卡菌和某些霉菌。但对肺囊虫最好的方法是单抗染色，尤其是对肺泡灌洗液和诱导痰样品更为适用。直接荧光抗体染色(DFA)用于检查下呼吸道中的军团菌，但敏感度只有50%-75%，不能代替培养。商业提供的DFA试剂可用于检查许多呼吸道病毒，包括呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、腺病毒、流感病毒、疱疹病毒。沙眼衣原体单抗和多抗荧光染色可用于婴儿呼吸道分泌物检测，分子扩增直接检测也有报道，对这些方法和试剂的敏感度与特异生有不同的报道，相差很大。
2. 常规培养 常规接种的培养基是5%羊血琼脂、麦康凯琼脂（分离革兰阴性菌）和巧克力琼脂（分离流感嗜血杆菌和奈瑟菌属）。为提高流感嗜血杆菌的分离率，有些实验室在巧克力琼脂中加入300μg/ml肝菌肽或50μg/ml万古霉素选择性地分离嗜血杆菌，巧 克力琼脂在划线后第一区间贴10μg/片杆菌肽纸片也可达到同样目的。由于存在口腔正常寄生菌的污染，痰和其他一般的下呼吸道标本并不接种营养丰富的液体培养基，也不做厌氧培养。
深咳痰、诱导痰、气管灌洗液等标本，因口腔寄生菌的污染，结果判断时应报告优势生长的需氧菌，为了使报告尽量可靠，实际操作中的平板分区划线接种条件要恒定，样品的收集和运送必须十分注意。培养结果的临床意义还应结合病人的症状和其他实验室检查数据一并考虑。很多引起下呼吸道感染的病原体在常规培养中查不出，临床需要时应以专门的手段检查。
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