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小鼠中的黄金矿脉-RenMabTM小鼠（一）

2021.3.08

抗体药发现的两大矿场

抗体药主要有两个大矿场，一个是依赖于体外展示技术的全合成/半合成/天然抗体文库矿，比较耳熟能详的是剑桥抗体技术公司（药王阿达木单抗）、后来的Dyax和现在的MorphoSys（特诺雅®古塞奇尤单抗注射液）。著名的矿主有2018年诺贝尔化学奖得主温特爵士（噬菌体展示平台）和MIT教授、AdiMab联合创始人K. Dane Wittrup教授（酵母展示平台）。另一个矿是基于天然免疫系统的抗体发现。最初大家都是用野生鼠免疫结合杂交瘤技术来发现抗体，后来基因泰克的卡比利ZL以及各种鼠源抗体人源化技术壁垒逼迫一些科学先驱另辟捷径，这就开启了人源化抗体鼠的时代。比较知名的有Xenomouse（安进的技术平台），Velocimouse（再生元的技术平台）、国内最近出现的百奥赛图的RenMab^TM鼠以及和铂医药的H2L2鼠。

从基因泰克的发展看抗体药成药性如何突破？

经过二十多年的发展，基于体外展示技术和合成抗体文库的体外抗体发现撞了成药性这个墙。最近七、八年整个领域都在反思到底问题出在哪里，到底该怎么寻求突破？在对全合成抗体的成药性的质疑声越来越强的时候，业内大佬们也在抓紧时间布局。

您是否注意到最近四五年基因泰克在抗体发现上全面转向了基于单细胞技术的体内抗体发现。这是为什么呢？基因泰克在上世纪九十年代的抗体工程非常卓有成效，上市了美罗华(Rituxan)、曲妥珠(Herceptin)等抗体药。但从2000年开始大量投入基于噬菌体展示技术的高通量筛选以后，新药产出效率却大大下降。基因泰克将何去何从？通过对一篇文章的解读大家一起来看一下。

这篇文章（Hotzel I et al, 2013 mAbs）由基因泰克Paul Carter和Robert Kelley一起发表，文章中要解决的问题只有一个：噬菌体展示出来的抗体在药物动力学(Pharmacokinetics)上是不是比人源化抗体差？

Fig. 1 52个抗体药物及在研抗体在食蟹猴中清除速率的回溯性研究

图Fig.1中Y轴是单抗药在食蟹猴体内的清除速率(mL/day/kg)，数值越大则药物动力学越差。X轴是52个已经上市或者是在研的抗体药物，包括大家耳熟能详的贝伐珠单抗、美罗华单抗、曲妥珠单抗、奥马珠单抗和帕妥珠单抗。在食蟹猴体内的清除速率10mL/day/kg（图中蓝色虚线）可以做为一个药物动力学好坏的分界值。

噬菌体展示来的抗体（△）在食蟹猴体内的清除速率的中位值是9.0mL/day/kg，人源化抗体（⚪）在食蟹猴体内的清除速率的中位值是6.5mL/day/kg，作者表示在统计学上并无显著性差异（P=0.28）。作者并没有做两者跟全人抗体的比较，可能由于全人抗体数据较少，但从有限的全人抗体数据来看，全人抗体（□）在食蟹猴体内的清除速率的中位值大概是3.1mL/day/kg，大家可以自行做个比较判断（Fig 2a）。虽然文中没有特意做数据差异比较，但相信这个发现应该也让Paul Carter和Robert Kelley非常震惊。因为基因泰克在2013年以后在抗体发现技术路线上的布局发生了变化，他们开始摒弃基于噬菌体展示的全合成抗体发现，并且大力投入基于单细胞抗体发现技术的体内抗体发现。

当然药物动力学是个很复杂的东西，影响因素很多，虽然此研究可能某方面不够严谨，但对于做商业决策来说，已经足够高大上了，基因泰克抗体发现理念也是非常让人赞同：那就是在抗体发现的早期来解决成药性问题。

Fig. 2. 抗体人源化以及亲和力工程改造对药物动力学的影响

这篇文章还有一个非常有意思的数据，Paul Carter和Robert Kelley选用了一个抗体（抗体47）来说明抗体工程化改造对体内药物动力学的影响。抗体47是基因泰克早期发现的一个抗人成纤维生长因子的抗体，经小鼠免疫获得。图Fig. 2B，抗体47c相对于原生抗体序列来说只除去了一个潜在的糖基化位点，在食蟹猴体内的清除速率是4.2 mL/day/kg （n=4）。抗体47b是在47c的基础上又做了亲和力优化，在食蟹猴体内的清除速率分别是9.3和8.2 mL/day/kg （n=2）。抗体47是在47c的基础上做了亲和力优化和化学稳定性优化，在食蟹猴体内的清除速率是20.4 mL/day/kg （n=4）。这个数据充分说明了一个问题，那就是经过体内免疫系统所发现的抗体的药物动力学是最好的，体外的工程学优化对于体内的药物动力学不但没有多少帮助，而且越做越糟。

上面这两个数据告诉大家：

（1）经过体内系统所发现的抗体的药物动力学是无可比拟的。体内系统所发现的抗体经过了免疫系统的正向选择和负向选择，抗原识别的专一性以及抗体的理化特性都是最好的。相比而言，用体外合成抗体文库所发现的抗体或多或少会存在抗原识别的多特异性问题，在抗体的理化特性上也不尽如人意。

（2）抗体的工程化改造。如果抗体需要做工程化改造的话，那就请最专业的团队用最专业的技术，结合抗体工程和蛋白结构、分子模拟来优化抗体的亲和力、稳定性和理化特性。

结合以上两点，您再仔细想一想抗体发现，如果想得到成药性最好的抗体并且尽可能的避免体外工程化改造，那目前最好的技术平台就是人源化抗体鼠。

RenMab鼠这座矿脱颖而出

众多人源化小鼠矿中，RenMab^TM小鼠从本专业挖矿砖家的眼中脱颖而出。那就让砖家从抗体发现角度为大家解读一下RenMab^TM小鼠这座矿与其他人源化小鼠矿相比究竟有什么独特之处？

经过一番仔细调查研究（某些制药公司的ZL读起来真让人头疼），砖家总结了以下几点：

（1）人源化抗体鼠的构建方式不同。

百奥赛图用自有知识产权的技术进行了原位替换，用人的整个抗体基因区全面替换了鼠的抗体基因区。再生元的Velocimmune鼠也使用了原位替换的方式，不同的是再生元做的是基于细菌假染色体的多个片段并且多个进程的同源重组。同源重组的构建方式导致了一些抗体多变区或者是调控元件的失活（McDonald L.E. et al, 2014 PNAS; Murphy A.J. et al, 2014 PNAS）。同样的失活在其它人源化抗体鼠比如Kymab鼠中也被观测到（Lee E.C., 2014 Nat. Biotechol）。原位替换的方式确保了人源化抗体鼠的免疫应答和野生鼠相似。相对于原位替换，其它的方式包括原位敲除鼠基因再插入人基因或者是敲除/失活鼠基因再异位插入人基因（Trianni鼠，Xenomouse鼠等等），这都或多或少影响了转基因小鼠的正常免疫应答，比较有名的例子是AlivaMab鼠。

（2）全区段原位替换最大程度地保证了抗体生成的多样性。

前面提到的敲除再插入的方式不可避免地会限制V区的选择，在某个可变区基因有多个拷贝或者突变型的情况下，只能选有代表性的V基因插入。多片段、多进程的方式会造成一些V基因的失活。原位敲除再异位插入会失去天然的抗体V（D）J重组的调控机制。RenMab^TM鼠的整个V区应该是所有的抗体人源化鼠中最天然的最接近于人的，人天然抗体基因的拷贝数、内在的各V区之间的原生调控序列以及各种突变型都被最大限度地保持。RenMab^TM鼠全区段原位替换的构建方式保证了RenMab^TM鼠正常的与野生鼠相似的免疫应答和抗体生成的多样性。

有看官会问，我明白你在说什么，那小鼠的抗体V（D）J重组机制和人的原生调控序列兼容吗？这是个非常出色的问题，也是学术界孜孜以求的一个研究方向。在解读RenMab^TM鼠的抗体V（D）J重组机制和人的原生调控序列兼容之前，咱们先看看RenMab^TM鼠发育正常吗？

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