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简并寡核苷酸引物PCR (DOP-PCR)

2019.3.25

实验方法原理	显微切割或流式分选的染色体经过PCR扩增制备整条染色体的DNA，被认为是对某条染色体全部涂染的高质量探针的首选途径。对于单个染色体、多色FISH(M-FISH)或光谱核型分析中所有24条染色体的涂染均是此种情况。下面提供的操作程序是简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)最原始操作程序的修改版本，适于用SpectrumOrange™dUTP或SpectrumGreen™dUTP扩增染色体DNA。此操作程序稍做修改或不做修改，就可以用各种其他的标记dUTP扩增染色体DNA。反应涉及的寡核苷酸，其5'端有XhoⅠ限制性内切核酸酶酶切位点，3'端有确定的寡聚六核苷酸序列和中间有一系列简并核苷酸序列（所有四核苷酸的随机混合）。从理论上计算表明在整个基因组中每4kb就有一个这种确定的六核苷酸序列。在合适条件下，用此序列作为引物的扩增可绕过特定的3'序列，也许通过一个或更多的简并核苷酸进行退火提髙稳定性，5'端特定序列使得该引物在较高的温度退火。在实际应用中，DOP-PCR操作程序开始的几个循环中用低退火温度（低保真PCR)，然后进行多个循环的高退火温度（高保真PCR)，产生随机扩增的DNA混合物。流式分选的染色体一般通过两轮DOP-PCR的扩增，其产物在荧光标记的三磷酸核苷酸存在的条件下进行第三轮扩增而得到标记。虽然缺口平移方法也可以用于标记进行染色体分析的探针，但获得高质量探针一般不需该步骤。
实验材料	流式细胞仪分选的染色体（每个PCR反应需500〜1000条染色体)
试剂、试剂盒	10×PCR缓冲液 PCR分析溶液 PCR标记缓冲液引物 Taq聚合酶
仪器、耗材	PCR仪
实验步骤	一般来说，流式分选的染色体进行重悬并在PCR分析缓冲液中扩增，PCR条件为：95°C、5min，然后9个循环的94°C、1min，30°C、1.5min，72°C、3min，升降温时间为2min、5s;接下来进行35个循环的94°C、15s，62°C、15s，72°C、15s(见注释8〜10);然后进行单独72°C延伸10min，最后保存在4°C。上述PCR产物在100μL体系中按照同一PCR条件进行再扩增。10μL扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，形成大小为300〜1000bp的成片条带。DNA的最终产量在1.5〜3.0μg。上述PCR产物在PCR标记缓冲液中，用扩增DNA的PCR条件进行标记。1〜21μL的标记DNA不用纯化就可直接用于杂交。
注意事项	1.在PCR操作中污染是非常严重的问题。为了避免PCR反应的污染，尽量用最好质量的试剂，这些试剂仅用于PCR。所有溶液最好分装，并冻存于-20℃备用。同时，用防气溶胶的管尖移液以减少交叉感染。指定实验室中一个区域专门用于PCR操作。如果可能，DNA样品的制备在单独实验室进行。另外，每次PCR实验操作选择合适的阴性对照（无靶序列）是非常重要的。 2.特定靶序列的PCR需要对Taq酶进行滴度测定。过多的酶可导致非特异性背景。 3.改变循环数目以确定获得最好信噪比的合适循环数。 4.大分子质量DNA(电泳时可见从胶孔到约2.0kb大小的成片条带）的存在表明标记的探针不合适。这种探针可导致非特异性、非细胞成分的髙背景，有时可以通过超声破碎降低背景。如注释9中提到的Taq酶滴定方式，确定合适的PCR循环数。