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PCR基本原理与过程

2023.2.28

变性-退火-延伸（图1）。

PCR中DNA的合成过程均以两个引物特异性结合处为起点。

引物通常是分别取自靶DNA序列两条链的3’端相向的长度在16~25nt的单链DNA片段，即引物头是5’，尾是3’。引物自身为靶DNA一端的互补序列，最终成为产物的组成部分。

耐热的DNA聚合酶 。在已发现的耐热DNA聚合酶中， Taq pol的活性最高，达200000U/mg，反应的最适温度为75-80℃，此时延伸速率达150-300个核苷酸/（秒·酶分子）。该酶具 5’->3’外切酶活性 ，不具3’->5’外切酶活性，故其不具Klenow酶的校对功能，在扩增过程中引起碱基错配概率大大增加，概率约1/300-1/18000，在经过25轮扩增后，扩增产物的序列中平均每400个碱基就有一个与原始序列不同。 Taq pol具有类似脱氧核糖核酸末端转移酶的活性（非模板依赖的聚合活性），特别对dATP的聚合能力最高，利用这一特性，我们可以构建dT-载体克隆dA尾的产物。同样，利用Klenow酶可以去除3’尾巴，生成平末端的产物。除 Taq pol，人们还陆续发现和获得了其他几种耐热DNA聚合酶，如 Th DNA聚合酶、 Vent DNA聚合酶、 Sac DNA聚合酶以及修饰 Taq pol聚合酶等。

延伸温度与时间 。尽管 Taq pol在75-80℃时活性最高，通常采用的延伸温度为72℃，此时的碱基掺入率约35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。通常扩增1kb以内的DNA片段延伸1min即可，而当代增序列长达3-4kb时，则需延长3-4min；然而当扩增小于150bp的片段时则可以省略延伸步骤，因为在退火温度下 Taq pol的活性已足以完成靶序列的合成。通常PCR最后一轮循环中可以适当将延长时间延长至4~10min，以使PCR反应完全提高扩增产量。在实际操作中，应注意前几轮循环的延伸时间要足够，以使靶序列延伸完全从而提高PCR反应的特异性。此外当待扩增DNA浓度较低时，由于碱基掺入率较低，可适当的延长反应延伸时间。

PCR终产物 分为复杂产物和长度特异产物两部分（图2）。 长度特异产物 是长度严格限定在两个引物链的5’端之间，是特异的目标片段。 复杂产物片段 是以包含有目标序列的初始DNA片段为模板所合成的PCR产物，其5’端为引物序列，而其3’端则远超出另一引物的结合区，以及以这样的DNA链为模板，另一引物结合并延伸形成的一端为双链特异产物部分，另一端为单链的复杂PCR产物。形成复杂产物片段的原因是：新合成的两条DNA链5’端分别是两引物的5’端，是固定不变的，而3’端则没有固定的止点，长短不一（其止点与模板长度、PCR延伸设定时间有关）。长度特异性产物因扩增长度一致（反应到目的片段的最后一个碱基即停止），而呈指数倍性（2 n ）增加。复杂产物片段以算数倍数（2n）增加，且有多种长度类型，导致每个特定分子质量的复杂产物片段的拷贝数很少，相比长度特异性产物其在PCR总产物中几乎可以忽略不计。这使得PCR的反应产物无需再纯化，就能保证足够的纯度用于随后的分析与检验。

PCR产物量 可用 P=N×(1+E) n 计算。P代表PCR产物的拷贝数，E代表平均每个热循环的PCR扩增效率，N代表起始模板拷贝数，n代表热循环次数。平均扩增效率理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。产物增长整体呈现“指数-线形-平台”模式（图3）。初期，因DNA聚合酶活力足、dNTP底物充足，模板浓度低而自身复性少，PCR扩增效率非常接近100%，产物呈现“指数”增长模式。随反应进行，受DNA聚合酶活力下降等原因，PCR效率接近0，最终停止反应而进入平台期。绝大多数情况下，经过 35 个循环，PCR扩增都将进入到平台期。

[1] 王廷华, 刘佳, 夏庆杰. PCR理论与技术[M]. 第三版. 背景:科学出版社, 2013:1-22.

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周锦帆