METTL3调控m6A甲基化修饰对小鼠脂肪细胞发育的重要作用
今 天我们为大家解读一篇今年4月3日发表在Nature communication（IF=11.878）的文章，作者研究了m6A修饰对小鼠脂肪组织发育的影响。
棕色脂肪组织(BAT)通过线粒体产生并耗散热量，对机体起到保暖和控制肥胖的重要作用，而BAT的出生后发育，正是它们获得这些功能的关键。已有研究表明m6A修饰可以调控白色脂肪细胞在体外分化，但是否也能影响棕色脂肪组织的发育还不得而知。因此，本文作者通过m6A测序&转录组测序检测了甲基化酶Mettl3敲除小鼠的BAT中甲基化水平和基因表达，探究了METTL3对BAT发育中关键基因的m6A修饰和表达的影响。
发表期刊：Nature Communications
影响因子：11.878
发表时间： 2020.4.3
实验方法: m6A-seq, RNA-seq（云序可提供以上服务）
文章链接：METTL3 is essential for postnatal development of brown adipose tissue and energy expenditure in mice
研究内容
（1）甲基化酶METTL3对肩胛间棕色脂肪组织发育起重要作用
首先，作者验证了相较白色脂肪组织（WAT），METTL3蛋白在肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）中更加富集，并且在iBAT发育过程中，METTL3蛋白与产热相关蛋UCP1的表达趋势一致，表明METTL3很可能对iBAT的出生后发育起到重要作用。
METTL3和UCP1在不同组织和发育过程中的表达
接着，作者敲除了小鼠iBAT中的Mettl3，通过与正常小鼠的比较，发现Mettl3敲除小鼠（BKO）的iBAT在发育过程中由于其中脂肪细胞脂滴积累而异常增大增重，并且产热相关蛋白UCP1的表达被抑 制，进一步表明METTL3与iBAT的出生后发育相关。
BKO小鼠和control小鼠METTL3和UCP1表达
（2）BAT中敲除Mettl3对基因表达的影响
为了研究iBAT发育中的分子机制，作者进行了RNA-seq(云序可提供此服务)，分析比较了BKO和正常小鼠的iBAT中基因的表达情况。GO分析表明BKO小鼠iBAT下调基因中富集了与发育、产热等功能相关基因，而上调基因中富集的多与炎症、肌肉发育相关。qPCR(云序可提供此服务)验证到iBAT的标志基因如adiponectin, aP2, Pparg, Glut4和 Cebpα在BKO小鼠中大幅降低，另外还有产热相关基因、线粒体氧化磷酸化相关基因被验证到下调。而被验证到的肌肉发育相关基因的上调，指示了METTL3缺失可能导致BAT向及细胞转化，影响iBAT正常发育。
BKO小鼠和control小鼠BAT中基因的表达
（3）BAT中敲除Mettl3对m6A修饰的影响
作者通过m6A-seq(云序可提供此服务)分析比较了敲除Mettl3对iBAT中mRNA的m6A修饰的影响。分析发现Mettl3敲除导致甲基化位点由集中在3’UTR区变为更加分散，大部分转录本的甲基化程度降低，甲基化位点motif也有所变化。
BKO小鼠和control小鼠BAT中的m6A修饰
联合RNA-seq(云序可提供此服务)，筛选出甲基化程度和表达均下调的iBAT标志基因Pparg,和产热相关基因Prdm16和Ucp1，并通过qPCR和MeRIP-qPCR进行了验证，荧光素酶实验(云序可提供以上服务)进一步验证了METTL3与这3个靶基因的3’UTR区结合，另外也验证了m6A reader蛋白YTHDF2和YTHDF3也与3个靶基因结合。这些实验结果暗示METTL3和YTHDF2/3共同作用调节BAT发育。
METTL3与Pparg，Prdm16和Ucp1结合
（4）体外细胞实验验证METTL3对棕色脂肪形成的作用
为验证METTL3是否直接影响棕色脂肪细胞的分化，作者分离出正常小鼠的棕色前体脂肪细胞，通过转染敲除Mettl3，发现前体细胞发生分化异常，并且其内棕色脂肪细胞标志基因、分化相关基因、产热相关基因、脂肪生成和分解基因、脂肪酸氧化基因等表达均下调。线粒体数量也下降了33%。这些结果提示METTL3对棕色脂肪的形成是必须的。
敲除Mettl3导致脂肪形成相关基因下调
（5）体内实验验证Mettl3基因对能量消耗的影响
为验证METTL3对产热的影响，比较了摄食量相等的情况下，BKO小鼠耗氧量和产二氧化碳量相对正常小鼠均下降，表明BKO小鼠产热量降低。血清中游离脂肪酸含量上升，也表明BKO小鼠产热能力异常。另外，慢性寒冷暴露实验还验证了Mettl3敲除影响了小鼠肩胛间白色脂肪细胞的棕色化。这些结果表明，Mettl3对小鼠通过BAT产热和御寒至关重要。
BKO小鼠和control小鼠耗氧量
（6）BAT中敲降Mettl3基因导致小鼠产生高脂肪饮食诱导的肥胖的倾向
已知产热降低可能会导致肥胖，为了验证Mettl3表达是否也会与胖相关，作者比较了高脂肪含量饮食喂食后的BKO小鼠和正常小鼠，发现BKO小鼠体重增加更多，脂肪重量增加，iBAT和肝脏增重并且重量比值增加，血清甘油三酯升高，染色显示BKO小鼠脂肪细胞肥大、肝脂肪积累， 这些表明BKO小鼠更倾向于发生高脂肪饮食诱导的肥胖。另外，葡萄糖耐受实验和胰岛素耐受实验表明Mettl3敲除会使小鼠产生胰岛素耐受，降低对葡萄糖的调节，导致系统能量平衡异常，引起肥胖。
敲除Mettl3对小鼠肝脏、胰岛素耐受的影响
总结
本文作者通过对敲除了甲基化酶Mettl3的小鼠和正常小鼠的棕色脂肪组织进行RNA-seq和m6A-seq，多组学联合分析，并结合qPCR、MeRIP-qPCR、荧光素酶实验和体内外表型实验，发现了棕色脂肪组织中甲基化酶METTL3和reader YTHDF2/3共同作用，结合iBAT标志基因Pparg,和产热相关基因Prdm16和Ucp1的3’UTR区调节m6A修饰和靶基因表达。而缺少METTL3会影响棕色脂肪细胞分化和棕色脂肪组织形成，导致小鼠产热减少，耐寒能力降低，并产生高脂肪饮食诱导的肥胖倾向。本文揭示了甲基化酶Mettl3通过调控m6A修饰从而影响小鼠棕色脂肪细胞的发育和能量平衡。
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