原位PCR的基本方法
①固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上,并用多聚甲醛处理,再灭活除去细胞内源性过氧化物酶.
②蛋白酶K消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55℃消化处理2h后,96℃2min以灭活蛋白酶K.
③PCR扩增:在组织细胞片上,加PCR反应液,覆盖并加液体石蜡后,直接放在扩增仪的金属板上,进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置.
④杂交:PCR扩增结束后,用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交.
⑤显微镜观察结果.
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综述
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技术原理