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转基因食品的检测

2020.8.17

摘要：本文论述了转基因农产品、食品的安全性问题以及对转基因食品从基因、基因转录、基因翻译表达三个层面的检测技术做了概述。关键词：转基因食品转基因农产品食品安全生物技术检测技术 Abstract: discuss on the question Genetically modified crops and Genetically modified food safety are discussed. The method of detection from gene and gene translation and gene express is given. Key words: Genetically modified crops Genetically modified food food Safety biotechnology Detection technology 随着生物技术的迅猛发展、基因工程技术已在农业领域中得到广泛运用。自二十世纪八十年代以来以基因改良为核心的农业生物技术正掀起第二次绿色革命。运用转基因技术（Gene transfer）能培育出优质、高产、抗病虫害、抗逆的优良品种，以缓解由于人口迅速增长、可耕地的减少、资源短缺、环境恶化而带来的农牧产品和食品短缺的危机。以农作物为例〔1〕自1994年第一例转基因延熟西红柿在美国批准上市以来，全球转基因作物种植面积迅猛扩大，由1996年的170万公顷增长到2002年的5870万公顷。转基因作物产品的全球销售额由1995年的0.75亿美元、1999年激增到21～23亿美元,预测2005年将达到80亿美元，2010年将突破250亿美元〔2〕。转基因农产品、食品的安全性问题 1.转基因农产品、食品引发的安全性思考随着转基因农产品、食品的迅猛增加，虽然其具有优质、高产等诸多优点，但由于转基因农产品和食品是把一种外源基因片断转移到目的物种中，从而改变目的物种的性状，特别是1998年发生的英国苏格兰Rowett研究所的Pusztai事件，虽后来被否定〔3〕，但接着1999年又发生的美国康奈尔大学Losey等报道的帝王蝶〔4〕事件至今尚在进一步验证之中。而巴西坚果蛋白质与其转基因大豆对人引起类似的过敏反应等事件，使人们对转基因农产品、食品的安全性提出众多质疑，例如：外源基因是否安全? 基因结构是否稳定且会不会产生有害人体健康的突变?基因转入后是否产生新的有害遗传性状或不利健康成分? 营养成分和其它功能性是否改变？转基因的标记基因是否会使人产生抗药基因? 是否会增加食物的过敏源〔5〕……消费者从自身健康考虑，提出转基因食品安全问题是非常自然的。转基因食品的安全性问题，已引发全球争论，对转基因食品这一新生事物做好安全性检测和评估是非常必要的。安全性评估主要包括有无毒性、有无过敏性以及抗生素抗性等标记基因的安全性。世界各国人们都在呼吁对转基因食品进行科学的评估。 2. 实质等同性原则〔6〕目前对食品安全性的评估均采用世界经济发展合作组织（OECD）1993年提出的实质等同性原则，即通过生物技术得到的转基因食品是否与目前市售常规食品有实质性的等同：⑴生物技术食品与传统食品有实质性等同。由于经过了长期的自然选择，机体已经对该种物质具有了良好的适应性，人类和自然环境对其也已经接受，对此类产品可不必进行安全检测与评估。⑵转基因产品与传统产品除某一插入的特定性状外，与非转基因动植物具有实质等同性。对这类转基因产品的检测应主要集中在对插入基因表达产物的检测上，不必过分强调分析其他性状，也不必考虑DNA和mRNA本身是否有毒性，因为所有生物体的DNA构件元素都是一样的。⑶转基因产品与传统产品没有实质的等同性且市场上没有与转基因食品相对应的传统产品，对该类产品则要求进行详细的安全性检测和评估，包括有无天然有毒物质、有无营养成分和抗营养因子、有无过敏源、转基因的稳定性和插入突变、基因的多效性和次级效应等。 3. 世界各国对转基因食品的认识和态度美国是转基因食品的积极倡导者，美国公民对转基因食品采取比较宽容的态度，其转基因作物的播种面积一直占据全世界的首位。他们认为转基因食品在上市之前要经过严格的市场准入检测，在实质上和传统的食品没有什么区别即可上市。美国由FDA、EPA、USDA负责转基因食品的评价、检测和监控。这些机构与联合国粮食组织（FAD）、世界卫生组织（WHO）和美国国家科学院（NAS）对新食品管理的原则是一致的〔7〕。欧盟对转基因食品持比较谨慎的态度，政府反对美国转基因食品涌入自己的国家。他们认为转基因食品通过生物技术将其他动物、植物、微生物的一段异源基因不定点插入目的食品，打破生物种间的界限会破坏自然的食品构成体系，造成基因水平的混乱，可能会导致一些遗传学或营养成分的非预期改变，从而危害人们的健康。同时也认为转基因食品的新组合和性状在不同遗传背景下表达，人们还缺乏其对环境、人类影响的认识，加之应用于生产和消费的时间还很短，不能拿出足够的证据来证明转基因食品对人的身体是完全安全的。但其中也不乏带有政治色彩的属于贸易壁垒的抵制。欧盟1996年制定的食品标签法规规定必须对转基因食品进行标签标注。在管理上分横向的与技术相关的法规和纵向的与产品相关的法规〔8〕。中东一些国家由于宗教的影响从社会伦理方面考虑对转基因食品比较排斥。南美、日本、韩国等属于比较中立的国家对转基因食品不像欧盟那样排斥也不像美国那样认可，他们都开始了转基因食品安全性的试验研究。我国既积极支持转基因技术的研究同时对对转基因食品采取比较谨慎的态度，认同国际上通行的转基因食品的实质等同性原则。我国国家科委1993年颁布了《基因工程安全办法》，1996年农业部正式实施《农业生物基因工程安全性管理法规》，对转基因农产品从试验研究、中间试验、环境释放到最后的商品化全过程进行安全性评价、并制定了相应的监督检测措施。2002年3月，正式实施《农业转基因生物安全评价管理办法》和《农业转基因生物标识管理办法》。这些政策和法规的颁布与实施对人们食用转基因食品提供了有力的保障。〔9〕转基因食品的检测方法鉴于全世界对转基因食品的安全性引起的关注和激烈争论，对转基因食品的检测显得尤为重要。基因工程技术是将克隆的外源基因通过基因枪法、农杆菌介导法等方法转入目的农作物中、使目的农作物中具有外源基因所具有的优良性状。对转基因食品的检测、从转基因技术本身来分析、可从基因水平、基因转录水平和基因翻译产物水平进行。 1. 基因水平的检测转基因技术将从各种生物中克隆出来的目的基因片断插入到靶向受体中时，一般要构建启动子、终止子、选择标记基因、报告基因等。从基因水平进行转基因的检测就是要检测受体的核酸序列、目的片断的整合位点、基因多态性、目的片断的含量分析以及启动子、终止子、选择标记基因、报告基因等。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） PCR法〔10〕对报检的样品运用PCR仪，针对外源基因设计合适的引物，通过TaqDNA酶的聚合快速特异地扩增目的基因片段，使目的基因片断以数量级速度在体外得到扩增从而可以在短短的几小时内使Pg水平的特异外源DNA片段扩增到ng乃至ug水平，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酞胺凝胶电泳，用溴化乙锭（EB）染色，在紫外光下就可观察到外源目的片断。 (1) 定性PCR法定性PCR可直接检测启动子、终止子、标记基因片断、目的基因片断。为使目的基因很好的进行表达，在构建基因表达载体时常在目的基因的5’和3’端分别加上启动子和终止子。当前大约75%的转基因植物中使用Ca MV( Cauliflower mosaicvirus) 3 5 S启动子，其次是胭脂碱和章鱼碱合成酶的NOS启动子和Ocs启动子。常用的终止子是胭脂碱合成酶的NOS终止子和Rubisco小亚基基因的3’端区域、所以当前对启动子和终止子的检测实际上是对Ca MV35S启动子和NOS终止子的检测。然而一些植物如十字花科植物易被CaMV感染而携带35S，故检测出阳性信号;而NOS终止子来源于普遍存在的农杆菌(Agrobacterium tume faciens )，因此，用PCR对35S启动子和NOS终止子进行检测时应配合其他检测。定性PCR受DNA抽提和纯化的影响，如果DNA降解或受污染，检测结果就会出现假阳性现象；只能初步确定是否为GMF但不能鉴定是哪种GMF。 (2) 定量PCR法在实际贸易和食品消费中我们不仅想知道食品是否是转基因的，而且还想知道其中外源基因的含量，即外源基因占GMF的百分含量。在普通的定性PCR扩增过程中，以不同浓度标准阳性样品作参照，标准阳性物用基因工程方法合成，上游引用荧光标记，下游引物不标记，在模板扩增的同时，标准阳性物也被扩增。。最后根据吸光值作出吸光值与转基因含量的标准曲线图，以此可以确定检测样品的转基因含量，这样可以进行半定量检测。 (3) 定量竞争性 QC一PCR法(Quantitative competitive PCR) 在PCR的反应管中，同时放入用人工合成用荧光标记的模板和待测样品让两者对同一引物同时扩增，反应完成后通过测定荧光强度推测待测样品的DNA含量。 (4) 实时定量荧光PCR法〔11〕实时定量荧光PCR技术是在常规PCR基础上，添加一条荧光标记基因探针（一般为Taq man）。一个标记在探针的5'端，一个标记在探针的3'端，两者构成能量传递结构，两个荧光集团根据距离控制是吸收或抑制，在PCR不断扩增中不断检测反应体系中荧光信号的变化，通过记录循环次数和PCR体系中起始DNA量的对数值之间的线性关系确定起始DNA的量。用实时定量荧光PCR对转基因食品进行检测可避免普通PCR反应过程中由于外界污染或样品本身DNA降解等原因造成的假阳性结果，但是实时定量荧光PCR仪价格昂贵，检测费用高。 (5)反转录RT-PCR法反转录PCR克服了待检样品中外源基因含量特别微量，以mRNA为模板反转录成cDNA，再通过PCR扩增进行检测。 (6) PCR—ELISA法 PCR一ELISA是I种将PCR高效性与ELISA高特异性结合在一起的转基因检测方法。利用共价交联在PCR管壁上的寡核普酸作为固相引物，在Taq酶作用下，以目标核酸为模板进行扩增，产物一部分交联在管壁上，为固相产物，一部分游离于液体中，为液相产物。对于固相产物，可用标记探针与之杂交，再用碱性磷酸酷酶标记的链亲和素进行ELISA检测，同时可通过凝胶电泳对液相产物进行分析。将PCR和ELISA两种方法相结合，可以相互取长补短，使检测的准确性大大提高。目前在我国尚未建立统一完备的转基因食品的筛选方法，随着转基因食品的数量增多及我国加入世界贸易组织，在我国建立转基因食品的筛选方法将对人群健康及生态环境的保护起积极的作用。 Southern杂交 Southern杂交技术在分子生物学中用于基因组DNA特定序列定位。在转基因食品中用Southern技术，是要在知道该转基因食品转入外源基因片断的情况下使用。以放射性或荧光标记的外源目的基因的同源序列作为探针与该食品原料农产品的总DNA进行杂交。首先用限制酶消化受体总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离所得的片断，随后使DNA在原位发生变性，并从凝胶转移至一固相支持体上。DNA转移至固相支持体的过程中，各个DNA片断的相对位置保持不变，用放射性或荧光标记的探针与各个DNA片断杂交，经放射自显影确定与探针互补的电泳条带的位置。Southern技术用于食品外源基因的检测可检测出外源基因与内源基因有高度同源性的DNA片断，且准确可靠，但对样品的纯度要求较高，费用也较高。基因芯片基因芯片〔12〕是20世纪80年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列的矩阵，基因芯片可以将目前通用的报告基因、抗性基因、启动子和终止子的特异片段(靶片段)固定于玻片上制成检测芯片，将从待检样品中提取的DNA扩增、标记后与芯片进行杂交，杂交信号由芯片扫描仪检测，再经计算机软件进行分析判断,其基本原理为通过杂交检测信号。基因芯片技术可对样品进行集约化和平行处理。利用基因芯片可实现对DNA的准确、快速、大信息量的检测。从而方便、快速地对大量待检测转基因作物进行灵敏、准确的检测。其不足之处是每种检测样品首先必须有与之相配的非转基因作物的芯片。 2. 基因转录水平检测 northern印迹杂交将northern技术用于外源基因的测定可测定特定外源基因DNA的转录产物mRNA分子的大小和丰度。RNA分子在变性琼脂糖凝胶中按其大小不同而相互分开，随后将RNA转移至活化纤维素、硝酸纤维素滤膜上。用放射性标记的外源DNA探针或RNA探针进行杂交和放射自显影，确定外源DNA的转录产物RNA。 3. 基因翻译表达水平的检测 1. 酶联免疫吸附反应(EL ISA)技术酶联免疫吸附试验(E nzy me一Linked Immunosorbent Assay, EL ISA)用于检测表达的目的蛋白，其基本原理是抗原抗体的特异性结合和酶对底物的高效催化。将针对目的蛋白的抗体包被在ELISA板上，加入待测物的溶液，经保温如待测物中含有转基因片断的表达产物即相应的蛋白，该蛋白作为抗原与包被的特异性抗体相结合。加入酶标记的针对目的蛋白的抗体，再经保温后加入酶反应底物显色，以酶联阅读仪测定OD值。 2. 蛋白芯片蛋白芯片的操作过程和基因芯片是一样的，只是其原理是利用抗原抗体的特异性结合而不是碱基对的互补杂交。 3. Westertern印迹法 Western印迹法的原理和Southern杂交、northern印迹杂交的原理相似，是抗原抗体的特异性结合。把从样品中提取的蛋白质用凝胶电泳分离成大小不同的分子作为抗原，并将其转移到固体支持物上，用含有放射性标记的抗体做探针与之杂交，通过放射性自显影检测外源基因的表达产物。Western印迹法与EL ISA所用都是抗原抗体的特异性结合，标记探针不同而已。一个为放射性标记，一个为酶标记。转基因食品检测的发展方向和趋势由于转基因食品直接关系到人们的身体健康和切身利益，所以对转基因食品的检测要求快速、准确、实用、操作简便。转基因食品的检测正朝着试剂盒的方向发展，DNA芯片技术在未来的转基因检测中的作用也越来越突出。

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周锦帆