抑肽酶的鉴别和检查方法
鉴别
(1)取本品与胰蛋白酶,分别加水溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液,各取10p1置点滴板上,混匀后,加对甲苯磺酰L精氨酸甲酯盐酸盐试液0.2ml,放置数分钟后,应不显紫红色。以胰蛋白酶溶液10山作对照,同法操作,应显紫红色。(2)在N-焦谷氨酰-抑肽酶和有关物质项下记录的色谱图中,供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。
检查
吸光度取本品,精密称定,加水溶解并定量稀释制成每1ml中含3.0单位的溶液,照紫外可见分光光度法(通则0401)测定,在277nm的波长处有最大吸收,吸光度不得过0.8。酸度取本品,加水溶解并稀释制成每1m中含5mg溶液,依法测定(通则0631),pH值应为5.0~7.0溶液的澄清度取本品,加水溶解并稀释制成每1ml中含2ng的溶液,依法检查(通则0902第一法),溶液应澄清高分子蛋白质照分子排阻色谱法(通则0514)测定供试品溶液取本品,加水溶解并定量稀释制成每1ml中含5单位的溶液。系统适用性溶液取经112℃加热2小时处理过的抑肽酶适量,加水溶解并稀释制成每1ml中含5单位的溶液。色谱条件以亲水的改性硅胶为填充剂G400WXL柱,7,8mm×300mm,8m或其他适宜的色谱柱),用3根色谱柱串联;以3mol/L醋酸溶液为流动相;流速为每分钟1.0ml;检测波长为28nm;柱温为35℃;进样体积100l。系统适用性要求系统适用性溶液色谱图中,二聚体峰相对抑肽酶峰的保留时间约为θ.9;二聚体峰与抑肽酶峰间的分离度应大于1.0;抑肽酶主峰的拖尾因子不得大于2.5。测定法精密量取供试品溶液,注入液相色谱仪,记录色谱图。限度供试品溶液色谱图中,保留时间小于抑肽酶主峰的均为高分子蛋白质峰,按峰面积归一化法计算,高分子蛋白质的总量不得大于1.0%。去丙氨酸-去甘氨酸-抑肽酶和去丙氨酸-抑肽酶照毛细管电泳法(通则0542)测定。供试品溶液取本品适量,加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含5单位的溶液。对照品溶液取抑肽酶对照品,加水溶解并定量稀释制成每1m中约含5单位的溶液电泳条件用熔融石英毛细管为分离柱(75μm×600m有效长度500mm);以120mmol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH2.5)为操作缓冲液;检测波长为214nm;毛细管温度为30℃;操作电压为12kV。进样端为正极,1.5kPa压力进样,进样时间为3秒。每次进样前,依次用0.1mol/L氢氧化钠溶液、去离子水和操作缓冲液清洗毛细管柱2、2和5分钟系统适用性要求对照品溶液电泳图中,去丙氨酸-去甘氨酸-抑肽酶峰相对抑肽酶峰的迁移时间为0.98,去丙氨酸-抑肽酶峰相对抑肽酶峰的迁移时间为0.99;去丙氨酸-去甘氨酸-抑肽酶峰与去丙氨酸-抑肽酶峰间的分离度应大于0.8,去丙氨酸-抑肽酶峰与抑肽酶峰间的分离度应大于0.5。抑肽酶峰的拖尾因子不得大于3测定法取供试品溶液进样,记录电泳图限度按公式100(r;/r)计算,其中r为去丙氨酸-去甘氨酸-抑肽酶或去丙氨酸-抑肽酶的校正峰面积(峰面积/迁移时间),rs为去丙氨酸-去甘氨酸-抑肽酶、去丙氨酸-抑肽酶与抑肽酶的校正峰面积总和。去丙氨酸-去甘氨酸-抑肽酶的量不得大于8.0%,去丙氨酸抑肽酶的量不得大于7.5%N-焦谷氨酰抑肽酶和有关物质照高效液相色谱法(通则0512)测定供试品溶液取本品适量,加流动相A溶解并稀释制成每1ml中约含5单位的溶液对照品溶液取抑肽酶对照品,加流动相A溶解并稀释制成每1ml中约含5单位的溶液。色谱条件用阳离子色谱柱( TSK-GEL IC-Cation-SW柱,7.8mm×750mm,10m或其他适宜的色谱柱);以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾3.52g、磷酸氢二钠7.26g,加水1000ml使溶解)为流动相A,以磷酸盐-硫酸铵缓冲液(取磷酸二氢钾3.52g、磷酸氢二钠7.26g、硫酸铵66.07g,加水1000ml使溶解)为流动相B,按下表进行梯度洗脱;流速为每分钟1.0ml;检测波长为210nm;柱温为40℃;进样体积40l时间(分钟)流动相A(%)流动相B(%)72系统适用性要求对照品溶液色谱图中,抑肽酶峰的保留时间为17~20分钟;N-焦谷氨酰-抑肽酶峰相对抑肽酶峰的保留时间为0.9;N-焦谷氨酰-抑肽酶峰与抑肽酶峰间的分离度应大于1.0;抑肽酶峰的拖尾因子应大于2. 测定法精密量取供试品溶液,注人液相色谱仪,记录色谱图。限度按峰面积归一化法计算,N-焦谷氨酰-抑肽酶的峰面积不得大于1.0%;单个未知杂质的峰面积不得大于0.5%,未知杂质峰面积的和不得大于1.0%水分取本品,照水分测定法(通则0832第一法1)测定,含水分不得过6.0%热原取本品,加灭菌注射用水溶解并稀释制成每1ml中含15单位的溶液,依法检查(通则1142),剂量按家兔体重每1kg注射1ml,应符合规定异常毒性取本品,加氯化钠注射液溶解并稀释制成每1ml中含4单位的溶液,依法检查(通则1141),应符合规定降压物质取本品,加氯化钠注射液溶解并稀释,依法检查(通则1145),剂量按猫体重每1kg注射1.5单位,应符合规定。
